Made available in DSpace on 2014-08-11T12:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) bernardina_morales_ipec_mest_2009.pdf: 1163368 bytes, checksum: f202e217c54ce0cedbcb4c79e65c8190 (MD5) bernardina_morales_ipec_mest_2009.pdf.txt: 105699 bytes, checksum: d49cfc5d18502e60aefc9acd95bd3a8b (MD5) bernardina_morales_ipec_mest_2009.pdf.jpg: 1571 bytes, checksum: d645520da44b852110b75eff2c71cf71 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Cryptococcus neoformans (C. n) e Cryptococcus gattii (C. g) são agentes da criptococose. A carência de publicações sobre teste de suscetibilidade de C. n e principalmente de C. g é evidente. A maioria de isolados clínicos de C. g mostra-se suscetível in vitro a fluconazol e itraconazol; no entanto o surgimento de resistência a drogas antifúngicas incentivou os testes de suscetibilidade in vitro. Como conseqüência, Clinical and Laboratory Standadards Institute \2013 CLSI, anteriormente National Committee for Clinical Laboratory Standards \2013 NCCLS, publicaram metodologia padronizada M27-A2 para alcançar reprodutibilidade e permitir a comparação de resultados de suscetibilidade entre laboratórios, porém alguns problemas como o tempo de incubação e o padrão de leitura levaram à busca de técnicas alternativas, tais como a citometria de fluxo. O objetivo deste trabalho é padronizar a técnica de citometria de fluxo para o teste de suscetibilidade in vitro de C.n e C.g. visando a redução do tempo de incubação, a utilização de leitura automatizada e a obtenção de resultados rápidos e reprodutíveis A concentração inibitória mínima (CIM) de 20 isolados de C.n e 21 de C.g foi determinada por citometria de fluxo e os resultados comparados com o protocolo padrão proposto pelo CLSI/M27A-2. Após duas horas de incubação com anfotericina B utilizando FUN-1, C. gattii resultou em 100% de concordância entre as duas técnicas para diluição de 2\03BCg/mL e 95,2% para 1\03BCg/mL e C. neoformans resultou em 100% de concordância para 1 e 2\03BCg/mL. Para azólicos e flucitosina, foram obtidos resultados reprodutíveis com o fluorocromo Acridine Orange após 18 horas de incubação, que resultou em 78% de concordância entre as duas técnicas para fluconazol, 85% para itraconazol e 97% para flucitosina. Em ambas as metodologias, C. gattii foi menos suscetível do que C. neoformans frente ao itraconazol e flucitosina (p<0,05). A citometria de fluxo é uma ferramenta útil, com potencial para testes in vitro e determinação da CIM dos antifúngicos estudados, com apreciável redução do tempo mínimo para obtenção de resultados / Cr yptococcus neoformans ( C.n ) and Cryptococcus gattii ( C.g ) are the agents of cryptococcosis. The lack of publications on susceptibility tests of C.n and especially C.g is evident. Most clinical isolates of C.g proved to be susceptible in vitro to fluconazol e and itraconazole and yet the emergence of resistance to antifungal drugs encouraged susceptibility testing in vitro . As a consequence, Clinical and Laboratory Standadards Institute – CLSI ( National Committee for Clinical Laboratory Standards – NCCLS ) pub lished standardized methodology to achieve reproducibility and allow comparison of susceptibility results between laboratories (M27 - A2 document) , however some problems of methodology, like incubation time and standard reading, led to the search for alterna tive techniques, such as flow cytometry. The objective of this work is to standardize the technique of flow cytometry to test the in vitro susceptibility of C . n and C . g in order to reduce the incubation time, use of automated reading and obtain fast and re producible results . The minimum inhibitory concentration (MIC) of 20 isolates of C.n and 21 of C.g was determined by flow cytometry and the results compared with the standard protocol proposed by CLSI/M27A - 2. Flow citometry showed 100% agreement with CLSI/ M27A - 2 results for 2 μ g/mL and 95.2% for 1 μ g/mL dilution when C.g isolates were tested, and 100% agreement for 1 and 2 μ g/ml dilution when C.n were tested after two hours of incubation with amphotericin B using FUN - 1 . Reproducible results were obtained with fluorochrome Acridin e Orange for azoles and flucytosine after 18 hours incubation, resulting in 78% agreement for fluconazole, 85% for itraconazole and 97% for flucytosine. C.g was less susceptible than C.n against itraconazole and flucytosine (p <0.05) in both methodologies. Flow cytometry is a useful tool, with potential for in vitro susceptibility test s of the antifungal agents studied, with appreciable reduction in the minimum time for achieving results.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-08T10:40:45Z No. of bitstreams: 1 Tese_Maria Luiza Silva.pdf: 18437840 bytes, checksum: 99e60f1ec0d4d9df9e50bbec11e91cd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-08T10:40:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Maria Luiza Silva.pdf: 18437840 bytes, checksum: 99e60f1ec0d4d9df9e50bbec11e91cd0 (MD5) / Neste trabalho, o perfil fenotípico e de síntese de citocinas pró-inflamatórias (IFN-, TNF- e IL-12) e reguladoras (IL-4, IL-5 e IL-10) em células da imunidade inata (neutrófilos, monócitos e células NK) e adaptativa (linfócitos CD4+, linfócitos CD8+ e linfócitos CD19+) do sangue periférico de indivíduos primo e/ou revacinados com a vacina antiamarílica 17DD, bem como um caso de reação adversa à vacinação foram investigados por citometria de fluxo após cultura rápida in vitro na ausência e presença da estimulação antígeno-específica. Foram avaliados 10 adultos saudáveis, com idade entre 21 e 51 anos, em 4 tempos distintos: antes da vacinação, 7, 15 e 30 dias após primovacinação. Após cultura in vitro foi observado um perfil global de citocinas pró-inflamatórias, transiente no 7° dia, principalmente devido às células da imunidade inata, seguido por perfil misto de citocinas inflamatórias e reguladoras nos 15° e 30° dias após a vacinação antiamarílica 17DD. Em um 2º estudo, foi observada uma resposta imune adaptativa robusta, acompanhada por anormalidades na resposta do sistema imune inato em um caso de evento adverso grave, seguido à vacinação 17D. Em adição, em um 3º estudo, foram incluídas 60 crianças com idade entre 9 e 47 meses, um ano após a primo e/ou revacinação antiamarílica 17DD, classificadas de acordo com os níveis de anticorpos neutralizantes antiamarílicos apresentados após a vacinação em: respondedoras (médios ou altos títulos de anticorpos neutralizantes), não respondedoras, respondedoras após revacinação e um grupo de crianças não vacinadas. Os dados da avaliação do impacto dos antígenos vacinais 17DD no perfil das citocinas dos leucócitos periféricos destas crianças demonstraram que, na presença de títulos médios de anticorpos neutralizantes após a primovacinação, o estímulo por antígenos vacinais 17DD in vitro foi capaz de induzir um perfil balanceado de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras, envolvendo células da imunidade inata e adaptativa, enquanto que uma assinatura polarizada reguladora foi observada no grupo de crianças primovacinadas não respondedoras e uma assinatura proeminente pró-inflamatória no grupo de crianças que apresentaram títulos altos de anticorpos neutralizantes após a primovacinação. Em conjunto os dados sugerem que uma resposta imune predominantemente do tipo balanceada, com síntese de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras, envolvendo tanto células da imunidade inata quanto da imunidade adaptativa parece ser essencial para a indução de uma resposta imune efetiva e segura após a vacinação antiamarílica. / In this study, phenotypic analysis and intracytoplasmic pro-inflammatory (IFN-, TNF- and IL-12) and regulatory (IL-4, IL-5 and IL-10) cytokines synthesis by innate (neutrophils, monocytes and NK cells) and adaptive (CD4+ and CD8+ T subsets, and CD19+) immunity cells of peripheral leucocytes of 17DD yellow fever (YF) prime or revaccinated volunteers, as well as a case of serious adverse events (YF-SAE) temporally associated with 17D YF vaccination were performed using short-term cultures, in absence or presence of YF-17DD-antigens, and single-cell flow cytometry. Ten healthy non-vaccinated volunteers, aged 21 to 51 years were evaluated at four consecutive periods including: before vaccination, 7, 15 and 30 days after vaccination. After whole blood cells culture, the overall cytokine signature showed a transient pro-inflammatory profile at day 7, mainly due to the innate immunity cells, which draws back toward a mixed or modulated pattern at day 15 and day 30 in most vaccines. In another study a robust adaptive response and abnormalities in the innate immune system were observed in one severe adverse event following primary YF-17D vaccination. In addition it was evaluated sixty healthy children with age raging from 9 to 47 months, one year after 17DD yellow fever prime or revaccination, classified according to anti-YF neutralizing antibodies results after vaccination as seroconverters (medium or high neutralizing antibodies levels), non-seroconverters, seroconverters after revaccination, and a unvaccinated group. The impact of YF-17DD-antigens recall on cytokine profiles of YF-17DD primo-vaccinated children characterized by single-cell flow cytometry after short-term cultures of whole blood samples demonstrate that the overall signature of high cytokine producers triggered by YF-Ag recall is associated with the levels of anti-YF neutralizing antibodies, with a balanced pro-inflammatory and regulatory profile of innate and adaptive immunity being the hallmark of seroconverters who presented medium neutralizing antibodies levels, whereas a polarized regulatory signature is observed in non-seroconverters and a prominent pro-inflammatory signature is characteristic of seroconverters who presented high neutralizing antibodies levels. Taken together, the results suggest that mixed type immune response, pro and anti-inflammatory, involving both innate immunity cells and adaptive immunity cells, it may play a pivotal role in the establishment of effective and safe immunization by yellow fever vaccine