Made available in DSpace on 2015-05-15T13:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 206.pdf: 1546363 bytes, checksum: 73a43a44e3cdc56dc0fc2e2aff0adeb9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O vírus da febre amarela (YFV, Yellow Fever Virus), um arbovírus da família Flaviridae,é o agente causador da febre amarela (FA), uma doença aguda, febril, não contagiosa, hemorrágica e potencialmente fatal. O YFV é endêmico em regiões tropicais da América do Sul e África. Apesar de sua significância como um problema de saúde pública, muitos mecanismos moleculares da biologia do YFV, como replicação do genoma e patogênese viral ainda não foram bem compreendidos. Avanços em genética reversa viral tem permitido a elucidação de mecanismos da biologia e comportamento viral, bem como a construção de vetores vacinais e desenvolvimento de drogas antivirais. No presente trabalho, descrevemos a construção e caracterização de um vírus recombinante de FA expressando o gene repórter da Gaussialuciferase (GLuc). Utilizando o sistema de recombinação homóloga em levedura, o gene repórter da Proteína Fluorescente Amarela (YFP, Yellow Fluorescent Protein) do vírus recombinante YFV-YFP-DENV1linker, previamente construído em nosso laboratório, foi substituído pelo gene repórter GLuc. A construção foi confirmada por PCR. Os RNAs virais genômicos foram sintetizados in vitro, e posteriormente transfectados em células BHK-21.As células transfectadas foram avaliadas por imunofluorescência indireta e mensuração do gene repórter GLuc. Dois clones foram recuperados e caracterizados em cultivo celular. Nós acreditamos que este vírus repórter deverá ser útilna triagem e desenvolvimento de drogas antivirais específicas, estudos de replicação virale competência vetorial, além da possível utilização como vetor viral vacinal

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-08T10:40:45Z No. of bitstreams: 1 Tese_Maria Luiza Silva.pdf: 18437840 bytes, checksum: 99e60f1ec0d4d9df9e50bbec11e91cd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-08T10:40:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Maria Luiza Silva.pdf: 18437840 bytes, checksum: 99e60f1ec0d4d9df9e50bbec11e91cd0 (MD5) / Neste trabalho, o perfil fenotípico e de síntese de citocinas pró-inflamatórias (IFN-, TNF- e IL-12) e reguladoras (IL-4, IL-5 e IL-10) em células da imunidade inata (neutrófilos, monócitos e células NK) e adaptativa (linfócitos CD4+, linfócitos CD8+ e linfócitos CD19+) do sangue periférico de indivíduos primo e/ou revacinados com a vacina antiamarílica 17DD, bem como um caso de reação adversa à vacinação foram investigados por citometria de fluxo após cultura rápida in vitro na ausência e presença da estimulação antígeno-específica. Foram avaliados 10 adultos saudáveis, com idade entre 21 e 51 anos, em 4 tempos distintos: antes da vacinação, 7, 15 e 30 dias após primovacinação. Após cultura in vitro foi observado um perfil global de citocinas pró-inflamatórias, transiente no 7° dia, principalmente devido às células da imunidade inata, seguido por perfil misto de citocinas inflamatórias e reguladoras nos 15° e 30° dias após a vacinação antiamarílica 17DD. Em um 2º estudo, foi observada uma resposta imune adaptativa robusta, acompanhada por anormalidades na resposta do sistema imune inato em um caso de evento adverso grave, seguido à vacinação 17D. Em adição, em um 3º estudo, foram incluídas 60 crianças com idade entre 9 e 47 meses, um ano após a primo e/ou revacinação antiamarílica 17DD, classificadas de acordo com os níveis de anticorpos neutralizantes antiamarílicos apresentados após a vacinação em: respondedoras (médios ou altos títulos de anticorpos neutralizantes), não respondedoras, respondedoras após revacinação e um grupo de crianças não vacinadas. Os dados da avaliação do impacto dos antígenos vacinais 17DD no perfil das citocinas dos leucócitos periféricos destas crianças demonstraram que, na presença de títulos médios de anticorpos neutralizantes após a primovacinação, o estímulo por antígenos vacinais 17DD in vitro foi capaz de induzir um perfil balanceado de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras, envolvendo células da imunidade inata e adaptativa, enquanto que uma assinatura polarizada reguladora foi observada no grupo de crianças primovacinadas não respondedoras e uma assinatura proeminente pró-inflamatória no grupo de crianças que apresentaram títulos altos de anticorpos neutralizantes após a primovacinação. Em conjunto os dados sugerem que uma resposta imune predominantemente do tipo balanceada, com síntese de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras, envolvendo tanto células da imunidade inata quanto da imunidade adaptativa parece ser essencial para a indução de uma resposta imune efetiva e segura após a vacinação antiamarílica. / In this study, phenotypic analysis and intracytoplasmic pro-inflammatory (IFN-, TNF- and IL-12) and regulatory (IL-4, IL-5 and IL-10) cytokines synthesis by innate (neutrophils, monocytes and NK cells) and adaptive (CD4+ and CD8+ T subsets, and CD19+) immunity cells of peripheral leucocytes of 17DD yellow fever (YF) prime or revaccinated volunteers, as well as a case of serious adverse events (YF-SAE) temporally associated with 17D YF vaccination were performed using short-term cultures, in absence or presence of YF-17DD-antigens, and single-cell flow cytometry. Ten healthy non-vaccinated volunteers, aged 21 to 51 years were evaluated at four consecutive periods including: before vaccination, 7, 15 and 30 days after vaccination. After whole blood cells culture, the overall cytokine signature showed a transient pro-inflammatory profile at day 7, mainly due to the innate immunity cells, which draws back toward a mixed or modulated pattern at day 15 and day 30 in most vaccines. In another study a robust adaptive response and abnormalities in the innate immune system were observed in one severe adverse event following primary YF-17D vaccination. In addition it was evaluated sixty healthy children with age raging from 9 to 47 months, one year after 17DD yellow fever prime or revaccination, classified according to anti-YF neutralizing antibodies results after vaccination as seroconverters (medium or high neutralizing antibodies levels), non-seroconverters, seroconverters after revaccination, and a unvaccinated group. The impact of YF-17DD-antigens recall on cytokine profiles of YF-17DD primo-vaccinated children characterized by single-cell flow cytometry after short-term cultures of whole blood samples demonstrate that the overall signature of high cytokine producers triggered by YF-Ag recall is associated with the levels of anti-YF neutralizing antibodies, with a balanced pro-inflammatory and regulatory profile of innate and adaptive immunity being the hallmark of seroconverters who presented medium neutralizing antibodies levels, whereas a polarized regulatory signature is observed in non-seroconverters and a prominent pro-inflammatory signature is characteristic of seroconverters who presented high neutralizing antibodies levels. Taken together, the results suggest that mixed type immune response, pro and anti-inflammatory, involving both innate immunity cells and adaptive immunity cells, it may play a pivotal role in the establishment of effective and safe immunization by yellow fever vaccine

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / A efetividade das vacinas contra febre amarela tem sido aferida indiretamentepelo sucesso das ações de vacinação em muitos países. Em que pese o sucesso das ações de vacinação no controle da doença, há questões pendentes sobre a imunogenicidade e reatogenicidade das vacinas disponíveis que precisam ser avaliadas para definição de estratégias das ações básicas de imunização na infância. Em um estudo observacional com a vacina 17DD, foi demonstrada menor imunogenicidade vacinal em crianças, principalmente com a aplicação simultânea da vacina contra sarampo (Grupo Colaborativo,2003). No atual calendário básico de imunizações há a possibilidade da aplicação simultânea das vacinas contra febre amarela e da vacina tríplice viral. Um ensaio clínico multicêntrico, randomizado, duplo-cego, foi realizado para investigar a imunogenicidade ea reatogenicidade das vacinas contra febre amarela (17D213/77 e 17DD) em crianças (Collaborative Group for Studies with Yellow Fever Vaccine, 2007) e definir os possíveisdeterminantes. A relevância deste estudo está na capacidade de obter dados para responder questões relativas às estratégias do Programa Nacional de Imunizações necessárias para adefinição das políticas públicas para controle e prevenção da doenças. A proporção de soroconversão e soropositividade pós-vacinal contra febre amarela em crianças aos 9 e 12meses de idade foi menor do que a observada previamente em ensaio clínico em adultos. Não houve diferença na imunogenicidade ou reatogenicidade das subcepas de vacinas contra febre amarela testadas (17D e 17DD). / A situação sorológica das mães não foi um fator determinante de menor soroconversão em crianças menores de 12 meses de idade, porém a presença de anticorpos pré-vacinais contra febre amarela em crianças menores de12 meses está associada a menor soroconversão. A vacinação simultânea contra febre amarela e tríplice viral afeta substancialmente a resposta imunológica para rubéola e febreamarela, mas não a vacina contra sarampo, o que pode influenciar de forma relevante as estratégias para controle da febre amarela e rubéola. A presença de anticorpos contradengue, independentemente de seu título, não interfere na imunogenicidade ou no padrão de reatogenicidade das vacinas contra febre amarela aplicadas em crianças residentes emáreas endêmicas. A proporção estimada de soronegatividade após duas doses de vacina contra febre amarela em crianças menores de 2 anos de idade foi de apenas 1,25 por cento. A ocorrência de casos esporádicos e surtos não permite que a idade recomendada para aprimovacinação seja deslocada para idades em que a vacina mostrou maiorimunogenicidade. Uma alternativa seria alterar o esquema primário de vacinação contra febre amarela para duas doses: mantendo a primeira dose aos 9 meses e aplicando umasegunda dose após 12 meses de vida. A aplicação da segunda dose aos 18 meses de idade seria conveniente para não coincidir com outras vacinas do calendário de imunizações. Aprimeira dose aos 9 meses seria mantida para proteger indivíduos de zonas endêmicas, o mais cedo possível. A segunda dose permitiria (1) imunizar um número adicional de crianças que não tinham respondido à primovacinação (falha primária), (2) reforçar respostas à primovacinação, e (3) ampliar as oportunidades de vacinar aqueles que não haviam recebido a primovacinação aos 9 meses.