O leite produzido a ultra alta temperatura denominado oficiamente como UHT é o leite de maior aceitação no mercado consumidor brasileiro. Com a finalidade de ampliar o conhecimento sobre a segurança microbiológica do leite UHT, objetivou-se estudar tanto os Bacillus spp, que vêm sendo relatados como contaminantes do leite UHT no Brasil, como os eventuais esporos sobreviventes ao processamento. A partir de 65 análises de leite UHT para a determinação de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis, no leite UHT procedente das indústrias sob Inspeção Federal no estado de São Paulo, 7 apresentaram contagens acima de 100 UFC/ml, indicando um percentual de 10,76 % de provas fora dos padrões para essa determinação, no período de jul a nov de 2003. Entretanto por atuação dos controles de qualidade das indústrias partidas foram inutilizadas e o leite que foi ao consumo apresentou 7,69% de microrganismos mesofílicos aeróbios acima dos padrões, sendo que 6.15% destes microrganismos foram considerados como Bacillus sporothermodurans. Dos isolamentos das contagens de microrganismos mesófilos acima dos padrões, foram efetuados estudos de seis cepas de Bacillus spp do leite UHT das indústrias, além de três cepas isoladas do leite UHT alvo de reclamações de consumidores procedente do Instituto Adolfo Lutz da capital de São Paulo. O objetivo do presente projeto foi, após a identificação cultural, microscópica, bioquímica e genética de culturas do Bacillus spp, estudar a patogenicidade das amostras em diversos modelos experimentais como: Teste do camundongo neonatos, alça ligada de coelho, inoculação intraperitoneal em camundongo BALB C e culturas celulares (Vero, HEp2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha). As 3 amostras isoladas de leite de reclamações dos consumidores do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo foram tipificadas preliminarmente pela técnica de Espectroscopia Infra-Vermelho a Transformada Fourier (FT- IR) como Bacillus flexus, enquanto que as amostras isoladas do leite procedente de três indústrias de São Paulo apresentaram presença de B. flexus e B.oleronius e Bacillus sporothermodurans. Exemplares de B.flexus testados quanto a patogenicidade apresentaram efeito citopático nas culturas celulares Vero, HEP2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha e morbidade em camundongo BALB C. O Bacillus sporothermodurans não apresentou patogenicidade a nenhum dos modelos biológicos citados. / The milk produced at ultra high temperature, denominated UHT, is the most popular milk in the Brazilian market. With the intention of increasing the knowledge of microbiologic safety in UHT milk, we concentrated our study on the Bacillus spp, described as the most important contaminants of UHT milk in Brazil, and on possible survivors of the processing procedures. From the 65 analysis of UHT milk collected to determine the presence of strict, aerobe, mesophile microorganisms and viable options, coming from industries under Federal Inspection in São Paulo state, 7 presented a microbial count higher than 100CFU/ml, indicating a percentage of 10.76% samples outside the standard for this determination, in the period between July and November 2003. However, due to the quality control in industries, batches were rendered useless and the milk that went for consumption presented 7.69% mesophile microorganisms above standard, being these organisms 6.15% was considered Bacillus sporothermodurans. From the isolation of mesophile Bacillus counts above average, 5 strains Bacillus spp species from UHT industries were studied, as well as 3 strains isolated from UHT milk denounced by consumers of São Paulo city\'s Adolfo Lutz Institute. The aim of the project, following cultural, microscopic, biochemical and genetic identification of the Bacillus spp, was to study pathogenicity in samples from several experimental models, such as: neonatal mice; rabbit ileum loops, intraperitoneal inoculation of BALB C mice and cell cultures: Vero, Hep2 and Chick Embryo Fibroblasts. The three isolated samples of milk denounced by São Paulo consumers were typified as Bacillus flexus by the Fourier Infrared Transformed Espectroscopy (IF-FR) technique, while isolated samples of milk from 3 industries in São Paulo, accused the presence of the B. flexus, B. oleronius and Bacillus sporothermodurans. Samples of the B. flexus tested in terms of pathogenicity presented a citopatic effect upon cell cultures Vero, HeP2 and Chick Embryo Fibroblasts and a morbidity in mice BalbC. The Bacillus Sporothermodurans did not present pathogenicity in any of the biological models mentioned.

Orientador: Stephen Hyslop / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T04:48:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_DelanoAnibalda_D.pdf: 1969731 bytes, checksum: de221836aebacda27e28c520b97a53e9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As peçonhas de himenópteros contêm diversas toxinas que podem causar hemólise, cardiotoxicidade e insuficiência renal, além de reação de hipersensibilidade. Adicionalmente, algumas vespas e formigas utilizam sua peçonha para imobilizar ou matar a presa. Neste estudo analisamos as atividades fosfolipásica (PLA2) e hemolítica bem como a atividade biológica sobre íleo e átrio isolados de rato, e sobre coração semi-isolado de barata, das peçonhas de formiga (Paraponera clavata) e vespa (Polistes lanio lanio). A eletroforese das peçonhas (SDS-PAGE) revelou a presença de componentes com massas moleculares de ~22 kDa a 100 kDa em P. clavata e de 19 a 119 kDa em P. l. lanio. Já a cromatografia por gel filtração resultou em cinco picos principais para a peçonha de P. clavata e seis para a de P. l. lanio. A peçonha de P. clavata possuiu atividades PLA2 e hemolítica moderadas, que foram abolidas pelo aquecimento (100ºC, 20 min). A peçonha de P. clavata (0,1-3 ?g/ml) contraiu íleo isolado de rato, cujo efeito foi dessensibilizante e resistente ao aquecimento da peçonha. Esta atividade contraturante foi localizada no primeiro pico do perfil de eluição da cromatografia por gel filtração. Em átrio isolado de rato a peçonha de P. clavata (0,125-10 ?g/ml) causou contratura, resultando em diminuição da força contrátil e redução na freqüência atrial com aumento na liberação de creatinoquinase-MB (CK-MB) tecidual. O aquecimento da peçonha não aboliu esta ação atrial. A análise histopatológica mostrou necrose dos cardiomiócitos que não foi afetada pelo aquecimento. Dos picos obtidos por gel filtração, o pico 1 reproduziu a contratura causada pela peçonha enquanto o pico 3 aumentou a contratilidade atrial. Em coração semi-isolado de barata, a peçonha de P. clavata (1-100 ?g) causou bradicardia. Conclui-se que a peçonha de P. clavata: (1) possui atividades PLA2 e hemolítica que são termolábeis, (2) causa bradicardia em coração semi-isolado de barata, e (3) provoca contração em íleo isolado e contratura em átrio direito de rato. Ao contrário de P. clavata, a peçonha de P. l. lanio (0,3-100 ?g/ml) mostrou altas atividades PLA2 e hemolítica que também foram abolidas pelo aquecimento (100ºC, 20 min). A peçonha contraiu íleo isolado de rato, e causou inotropismo negativo em átrio direito isolado de rato, sem afetar o cronotropismo; não houve contratura da linha basal. A peçonha causou forte bradicardia em coração semi-isolado de barata que não foi abolido pelo aquecimento (100ºC, 20 min). Este cronotropismo negativo foi mediado por uma fração da peçonha de P. l. lanio enriquecida em componentes de baixa massa molecular (<5 kDa, obtida através da ultrafiltração). A cromatografia desta fração em HPLC de fase reversa resultou em seis picos, dos quais apenas o pico 4 causou bradicardia em coração semi-isolado de barata. A bradicardia foi bloqueada pela glibenclamida, sugerindo o envolvimento de canais de K+ dependentes de ATP neste fenômeno. A análise do pico ativo por espectrometria de massas indicou a presença de peptídeos. Conclui-se que a peçonha de P. l. lanio: (1) tem alta atividade fosfolipásica e hemolítica (ambas termolábeis), (2) provoca contração de íleo e inotropismo negativo em átrio direito de rato e (3) exerce forte cronotropismo negativo em coração semi-isolado de barata mediado pela ativação de canais de potássio dependentes de ATP / Abstract: Hymenoptera venoms contain toxins that can cause hemolysis, renal failure, cardiotoxicity and hypersensitivity in humans. Additionally, some wasps and ants use their venom to immobilize or kill prey. In this study, we analyzed the phospholipase (PLA2) and hemolytic activities of ant (Paraponera clavata) and wasp (Polistes lanio lanio) venoms, and their action on rat isolated ileum and right atrium and cockroach semi-isolated heart. Electrophoresis (SDS-PAGE) showed that the venoms of P. clavata and P. l. lanio contained components with molecular masses of ~20-100 kDa and 19-119 kDa, respectively. Gel filtration chromatography resulted in five major peaks for P. clavata venom and six for P. l. lanio. Paraponera clavata venom had moderate phospholipase and hemolytic activities that were abolished by heating (100ºC, 20 min). This venom (0.1-3 ?g/ml) contracted rat isolated ileum, with a desensitizing effect, and heating the venom did not abolish this activity, which was located in the first peak of the gel filtration elution profile. In isolated atria, the venom (0.125-10 ?g/ml) caused muscle contraction that resulted in decreased contractile force and a reduction in atrial rate, with an increase in creatine kinase-MB (CK-MB) release; this atrial action was not abolished by heating. Histopathological analysis revealed myonecrosis that was also unaffected by heating. Of the peaks obtained by gel filtration, peak 1 reproduced the contraction observed with the venom whereas peak 3 caused a sustained increase in atrial contractility. The venom (1-100 ?g) caused bradycardia in cockroach semi-isolated hearts. These results show that P. clavata venom: (1) has PLA2 and hemolytic activities that are thermolabile, (2) causes bradycardia in cockroach semi-isolated hearts, and (3) contracts rat isolated ileum and causes contracture of rat right atria. In contrast to P. clavata, P. l. lanio venom (0.3-100 ?g/ml) showed high PLA2 and hemolytic activities that were also abolished by heating (100°C, 20 min). Polistes l. lanio venom contracted rat isolated ileum and produced negative inotropism in isolated rat right atria; there was no effect on the chronotropic response or on the baseline tension, i.e., no muscle contracture. The venom caused marked bradycardia in coackroach semi-isolated hearts that was unaffected by heating. This bradycardia was mediated by a low-molecular mass fraction of the venom (<5 kDa, obtained by ultrafiltration). RP-HPLC of this fraction resulted in six peaks, of which only the fourth caused bradycardia in cockroach semi-isolated hearts. This bradycardia was blocked by glibenclamide, suggesting the involvement of ATP-dependent K+ channel activation. Mass spectrometry of the active peak indicated the presence of peptides. These results indicate that P. l. lanio venom: (1) has high PLA2 and hemolytic activities that are thermolabile, (2) contracts rat isolated ileum and reduces the contractile force of isolated right atria, and (3) causes marked bradycardia in cockroach semi-isolated heart via the activation of ATP-dependent K+ channels / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

O leite produzido a ultra alta temperatura denominado oficiamente como UHT é o leite de maior aceitação no mercado consumidor brasileiro. Com a finalidade de ampliar o conhecimento sobre a segurança microbiológica do leite UHT, objetivou-se estudar tanto os Bacillus spp, que vêm sendo relatados como contaminantes do leite UHT no Brasil, como os eventuais esporos sobreviventes ao processamento. A partir de 65 análises de leite UHT para a determinação de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis, no leite UHT procedente das indústrias sob Inspeção Federal no estado de São Paulo, 7 apresentaram contagens acima de 100 UFC/ml, indicando um percentual de 10,76 % de provas fora dos padrões para essa determinação, no período de jul a nov de 2003. Entretanto por atuação dos controles de qualidade das indústrias partidas foram inutilizadas e o leite que foi ao consumo apresentou 7,69% de microrganismos mesofílicos aeróbios acima dos padrões, sendo que 6.15% destes microrganismos foram considerados como Bacillus sporothermodurans. Dos isolamentos das contagens de microrganismos mesófilos acima dos padrões, foram efetuados estudos de seis cepas de Bacillus spp do leite UHT das indústrias, além de três cepas isoladas do leite UHT alvo de reclamações de consumidores procedente do Instituto Adolfo Lutz da capital de São Paulo. O objetivo do presente projeto foi, após a identificação cultural, microscópica, bioquímica e genética de culturas do Bacillus spp, estudar a patogenicidade das amostras em diversos modelos experimentais como: Teste do camundongo neonatos, alça ligada de coelho, inoculação intraperitoneal em camundongo BALB C e culturas celulares (Vero, HEp2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha). As 3 amostras isoladas de leite de reclamações dos consumidores do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo foram tipificadas preliminarmente pela técnica de Espectroscopia Infra-Vermelho a Transformada Fourier (FT- IR) como Bacillus flexus, enquanto que as amostras isoladas do leite procedente de três indústrias de São Paulo apresentaram presença de B. flexus e B.oleronius e Bacillus sporothermodurans. Exemplares de B.flexus testados quanto a patogenicidade apresentaram efeito citopático nas culturas celulares Vero, HEP2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha e morbidade em camundongo BALB C. O Bacillus sporothermodurans não apresentou patogenicidade a nenhum dos modelos biológicos citados. / The milk produced at ultra high temperature, denominated UHT, is the most popular milk in the Brazilian market. With the intention of increasing the knowledge of microbiologic safety in UHT milk, we concentrated our study on the Bacillus spp, described as the most important contaminants of UHT milk in Brazil, and on possible survivors of the processing procedures. From the 65 analysis of UHT milk collected to determine the presence of strict, aerobe, mesophile microorganisms and viable options, coming from industries under Federal Inspection in São Paulo state, 7 presented a microbial count higher than 100CFU/ml, indicating a percentage of 10.76% samples outside the standard for this determination, in the period between July and November 2003. However, due to the quality control in industries, batches were rendered useless and the milk that went for consumption presented 7.69% mesophile microorganisms above standard, being these organisms 6.15% was considered Bacillus sporothermodurans. From the isolation of mesophile Bacillus counts above average, 5 strains Bacillus spp species from UHT industries were studied, as well as 3 strains isolated from UHT milk denounced by consumers of São Paulo city\'s Adolfo Lutz Institute. The aim of the project, following cultural, microscopic, biochemical and genetic identification of the Bacillus spp, was to study pathogenicity in samples from several experimental models, such as: neonatal mice; rabbit ileum loops, intraperitoneal inoculation of BALB C mice and cell cultures: Vero, Hep2 and Chick Embryo Fibroblasts. The three isolated samples of milk denounced by São Paulo consumers were typified as Bacillus flexus by the Fourier Infrared Transformed Espectroscopy (IF-FR) technique, while isolated samples of milk from 3 industries in São Paulo, accused the presence of the B. flexus, B. oleronius and Bacillus sporothermodurans. Samples of the B. flexus tested in terms of pathogenicity presented a citopatic effect upon cell cultures Vero, HeP2 and Chick Embryo Fibroblasts and a morbidity in mice BalbC. The Bacillus Sporothermodurans did not present pathogenicity in any of the biological models mentioned.