(3R,5R)-Clavulanic acid is a clinically important inhibitor of Class A β-lactamases. Progress has been made in to establishing the steps of clavulanic acid biosynthesis leading to (3S,5S)-clavaminic acid. However, the mechanism by which (3S,5S)-clavaminic acid is converted to the penultimate intermediate (3R,5R)-clavaldehyde remains elusive. It is believed that the products of the later genes (orf10-orf18) of the clavulanic acid biosynthesis gene cluster are probably involved in this conversion. Part I of this thesis describes biochemical and structural studies carried out on OAT2, a member of N-terminal nucleophile (Ntn) hydrolase superfamily of enzymes. OAT2 has been characterised to be an ornithine acetyl transferase (OAT) and is involved in clavulanic acid biosynthesis. OAT2 catalyses the reversible transfer of the acetyl group between N-acetyl-L-ornithine and L-glutamate. It was found that this reaction is catalysed via the formation of an acyl-enzyme intermediate. Subsequent studies including mass spectrometry, 13C NMR spectroscopy, infrared spectroscopy, X-ray crystallography and molecular dynamics simulations, further confirmed the viability of the intermediate. This acyl-enzyme intermediate of OAT2 was found to be exceptionally stable at physiological pH, as compared to the acyl-enzyme intermediates involved in catalysis by hydrolytic enzymes including proteases, Ntn hydrolases and β-lactamses. The X-ray studies revealed possible reason for this unusual stability. The infrared studies revealed two conformations for the acyl-enzyme. Modeling (MDS) studies assigned one of these to the structure observed by X-ray and proposed the other one to result from a hydroxyl hydrogen 'flip' involving the oxyanion hole component Thr-111 resulting in a singly hydrogen bonded acyl-enzyme intermediate. α, β Subunit co-expression studies with OAT2 were used to investigate the autocatalytic cleavage step. In one case an interesting N-acyl enzyme species was observed. Part II of this thesis describes efforts carried out to characterise the ORF10 and ORF15 proteins of clavulanic acid biosynthesis. ORF10 was characterised to be an 'active' cytochrome P450 and ORF10 crystals were obtained in the presence spinach ferredoxin, highlighting the role of the ferredoxin interaction in assisting ORF10 crystallisation. ORF15 was shown to be a probable peptide transporter, which binds bradykinin as observed in the crystal structure.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6193.pdf: 1697828 bytes, checksum: 4cc53ac247e8d63c069aaa864a656b3a (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Clavulanic acid (CA) produced by Streptomyces clavuligerus, is a potent inhibitor of beta-lactamases used in combination with conventional beta-lactam antibiotics in the treatment of infections caused by resistant bacteria to these antibiotics. The biosynthesis of CA is limited by high concentrations of carbon source and like other beta-lactam compounds, it is highly unstable in acidic or basic pHs even at moderate temperatures. In this work, it was investigated different strategies to improve the production of AC. Batch and batch cultivations with glycerol pulses were carried out in shaker at 250 rpm and pH 6.8 at constant temperatures of 20, 25 and 30°C (run control), as well as with temperature reduction after cell growth phase from 30 to 25°C, 30 to 20°C and 25 to 20 C. It was also investigated the effects of temperature and pH on the AC degradation at various cultivation times in the presence of different concentration of ammonium ion. It was observed that the use of low temperatures (20°C) during cultivation reduced the substrate uptake rate and provides a higher accumulation of AC, in the broth by reducing the effects of CA degradation and inhibition effects caused by carbon source. Batch cultivations with higher glycerol concentration (30 and 60 g/L) were also performed at low temperature (20 and 25°C). The results confirmed that glycerol inhibits or even represses the biosynthesis of CA, depending of the temperature condition employed. The highest CA concentration value (1543 mg/L) were obtained for the cultivation at 20°C and 30 g/L glycerol, 9.2 fold-higher than run control at 30°C. The kinetics of CA degradation at pHs 6.5 and 7.5 and at different concentrations of ammonium ion (0 to 1000 mg/L) were also evaluated. It observed that the degradation was highest at pH 7.5 and higher concentration of ammonium ion. For all proposals of cultivations for CA production, it was obtained a maximum CA concentration in fermentation broth of about 1.5 g/L, indicating that CA acts as an inhibitor of its own biosynthesis. Then, the potential CA removal from broth culture was evaluated by using of alternative adsorbents such as activated carbon, clinoptilolite calcined hydrotalcite, and an ion exchange resin Amberlite IRA 400, for application in extractive fermentation process. The use of resin IRA 400 as an adsorbent to remove CA during cultivation resulted in an increase of 48% in maximum CA concentration if compared with cultivation at the same temperature condition (20°C) and glycerol concentration (15 g/L) conducted without product removal, confirming the hypothesis of inhibition by product in the CA production process. In cultivation at 20°C with glycerol concentration of 30 g/L and product removal, it was obtained a highest CA production of 2841 mg/L. The results indicate that the use of low temperature combined with the removal of product during the production process of AC represent a new and effective strategies to greatly increase the yield of CA. / O ácido clavulânico (AC), produzido pela bactéria Streptomyces clavuligerus, é um potente inibidor de beta-lactamases utilizado em combinação com antibióticos betalactâmicos convencionais no tratamento de infecções causadas por bactérias resistentes a estes antibióticos. A biossíntese de AC é limitada por altas concentrações de fonte de carbono e assim como outros compostos beta-lactâmicos, é altamente instável em pH s básicos ou ácidos, mesmo em temperaturas moderadas. No presente trabalho, foram investigadas diferentes estratégias de melhoria da produção de AC. Foram realizados cultivos em batelada e batelada com pulsos de glicerol em mesa incubadora rotativa a 250 rpm e pH 6,8 em temperaturas constantes de 20, 25 e 30ºC (controle), bem como cultivos com redução de temperatura após a fase de crescimento celular de 30 para 25ºC, 30 para 20ºC e 25 para 20ºC. Foram também investigados os efeitos da temperatura e do pH na degradação de AC em diferentes tempos de cultivo e na presença de íons amônio. Observou-se que o uso de baixas temperaturas (20ºC) durante o cultivo reduz a velocidade de consumo de substrato e proporciona um maior acúmulo de AC, ao reduzir os efeitos de degradação e os efeitos de inibição pela fonte de carbono. Foram também realizados cultivos em batelada com alta concentração de glicerol (30 e 60 g/L) a baixa temperatura (20 e 25ºC). Os resultados confirmaram que o glicerol inibe ou até reprime a biossíntese de AC, dependendo da condição de temperatura empregada. Os maiores valores de concentração de AC foram obtidos para o cultivo a 20ºC e 30 g/L de glicerol (1543 mg/L), valor 9,2 vezes maior que o cultivo controle em batelada a 30ºC. As cinéticas de degradação de AC em pH s 6,5 e 7,5 e em diferentes concentrações de íons amônio (0 a 1000 mg/L) também foram avaliadas. Verificou-se que a degradação foi acentuada em pH 7,5 e com maiores concentrações de íons amônio. Para todas as propostas de cultivos de produção de AC, obteve-se uma concentração máxima de AC no caldo de cerca de 1,5 g/L, indicando ser o AC inibidor da sua própria biossíntese. Foram então avaliados os potenciais de remoção de AC do caldo de cultivo por adsorventes alternativos como carvão ativado, clinoptilolita e hidrotalcita calcinada, e por uma resina de troca iônica, Amberlite IRA 400, para aplicação no processo de fermentação extrativa. O uso de resina IRA 400 como adsorvente para remover AC durante o cultivo resultou num aumento de 48% na concentração máxima de AC em comparação com o cultivo na mesma condição de temperatura (20ºC) e concentração de glicerol inicial (15 g/L) realizadas sem a remoção do produto, comprovando a hipótese de inibição pelo produto no processo de produção de AC. Em cultivo a 20ºC com concentração de glicerol de 30 g/L e remoção de produto, obteve-se uma alta produção de AC de 2841 mg/L. Os resultados indicam que o uso de baixa temperatura aliado à remoção de produto durante a produção de AC representam novas e eficientes estratégias que elevam sobremaneira o rendimento da produção de AC.

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O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32°C, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32°C e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32°C é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC. No estudo da determinação do coeficiente de transferência de massa, kLa, sem crescimento microbiano, observaram-se valores maiores de kLa para o SF, devido à viscosidade do PEG utilizado no SFE. A massa molar do PEG e a velocidade de agitação foram as variáveis que mais influenciaram na extração de AC no SFE em frascos agitados, apresentando comportamento semelhante em biorreator. E, finalmente, o estudo da transferência de oxigênio do SFE utilizando SDFA com crescimento microbiano foi avaliado para otimizar a produção e a extração de AC. Os resultados obtidos demonstraram que existe uma faixa ideal de velocidade de agitação e de aeração para evitar o rompimento celular e aumentar a recuperação de AC. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 °C, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 °C and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 °C is the maximum temperature production of CA, after this value, starts gradually, the degradation of CA. In the study of volumetric mass transfer coefficient, kLa, without microbial growth, showed higher values of kLa for the SF, because the high viscosity of the PEG used in the SFE. The PEG molar mas and agitation velocity were the variables that most influenced the extraction of CA in flasks using a SFE, with similar behavior in a bioreactor. Finally, the study of oxygen transfer rate in SFE using ATPS with microbial growth was evaluated to optimize the production and extraction of CA. The results showed that there is an ideal range of agitation and aeration to prevent cell disruption and increase the CA recovery.

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32°C, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32°C e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32°C é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC. No estudo da determinação do coeficiente de transferência de massa, kLa, sem crescimento microbiano, observaram-se valores maiores de kLa para o SF, devido à viscosidade do PEG utilizado no SFE. A massa molar do PEG e a velocidade de agitação foram as variáveis que mais influenciaram na extração de AC no SFE em frascos agitados, apresentando comportamento semelhante em biorreator. E, finalmente, o estudo da transferência de oxigênio do SFE utilizando SDFA com crescimento microbiano foi avaliado para otimizar a produção e a extração de AC. Os resultados obtidos demonstraram que existe uma faixa ideal de velocidade de agitação e de aeração para evitar o rompimento celular e aumentar a recuperação de AC. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 °C, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 °C and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 °C is the maximum temperature production of CA, after this value, starts gradually, the degradation of CA. In the study of volumetric mass transfer coefficient, kLa, without microbial growth, showed higher values of kLa for the SF, because the high viscosity of the PEG used in the SFE. The PEG molar mas and agitation velocity were the variables that most influenced the extraction of CA in flasks using a SFE, with similar behavior in a bioreactor. Finally, the study of oxygen transfer rate in SFE using ATPS with microbial growth was evaluated to optimize the production and extraction of CA. The results showed that there is an ideal range of agitation and aeration to prevent cell disruption and increase the CA recovery.

As técnicas espectroscópicas utilizam a interação entre luz e matéria como forma de obter informações das características moleculares de um sistema. Os diversos níveis de energia manifestam-se em bandas espectrais que ao serem interpretadas fornecem características sobre estrutura, orientação e interações a nível molecular. O presente trabalho explorou as diversas facetas espectroscópicas, aliadas a técnicas biofísicas/bioquímicas, no intuito de compreender melhor dois tipos de biomoléculas importantes para a maquinaria dos seres vivos: proteínas e peptídeos. O citocromo P450 é uma enzima do tipo monooxigenase e constitui uma das maiores superfamílias de proteínas. Essa hemoproteína foi assim nomeada devido à sua característica absorção na região da Banda de Soret (450 nm), sendo esta uma particularidade natural muito utilizada em estudos por espectroscopia. Além disso, existe interesse de estudar esta família de proteínas em virtude de suas variadas funções metabólicas e biossintéticas, nos mais diversos organismos, como catalisação de esteróides, ácidos graxos, fármacos, carcinógenos químicos e metabólitos de plantas. Em especial, para a P450 de Streptomyces clavuligerus (P450CLA), ainda não se sabe ao certo como e com quais moléculas interage, e como funciona o mecanismo utilizado pela proteína para atuar em vias de síntese como a do ácido clavulânico, importante composto terapêutico. Paralelo ao paradigma de interação de uma proteína e potenciais ligantes, o entendimento dos mecanismos de interação entre peptídeos e membranas lipídicas também são de suma importância para uma melhor compreensão dos sistemas biomoleculares. Peptídeos ativos na membrana desempenham funções fundamentais no sistema de defesa de diversos organismos e decifrar os mecanismos de como essas biomoléculas agem quando inseridas em bicamadas lipídicas pode auxiliar, por exemplo, no desenvolvimento de terapias seguras e eficientes contra doenças degenerativas. Desta forma, aproveitamos as características espectroscópicas naturais de ambas as moléculas para serem empregadas em técnicas de absorção UV/vis, Dicroísmo Circular Eletrônico e Magnético, Ressonância Paramagnética Eletrônica e Ressonância Magnética Nuclear, auxiliados por técnicas termodinâmicas e de fluorescência, de modo a explorar a interação da luz com a matéria, sem interferências de sondas externas, dando enfoque às alterações de estrutura e orientação, nas mais variadas formas de interação entre moléculas de sistemas biológicos. / Spectroscopic techniques use the interaction between light and matter as a way for obtaining information about molecular characteristics of a system. The many energy levels manifest themselves in spectral bands, which when are interpreted, it provides characteristics about structure, orientation and interactions at the molecular level. The present study explored the various spectroscopic facets, allied to biophysical/biochemical techniques, in order to understand better two important biomolecules types for living beings machinery: proteins and peptides. Cytochrome P450 is a monooxygenase-like enzyme and it belongs to one of the largest proteins superfamilies. The hemoprotein received this name due its unique spectral absorption in Soret Band region (450 nm), a natural particularity widely used in spectroscopic studies. In addition, there is interest in studying this protein family by virtue of their several metabolic and biosynthetic functions in the most diverse organisms, such as steroids, fatty acids, drugs, chemical carcinogens and plant metabolites. In particular, regarding P450 from Streptomyces clavuligerus (P450CLA), it is still unclear how and which molecules it interacts with, and how the mechanism used by the protein to act in synthesis pathways such as clavulanic acid, an important therapeutic compound. Parallel to the interaction paradigm between proteins and potential ligands, the interaction mechanisms understanding between peptides and lipid membranes are also of paramount importance for a better understanding of the biomolecular systems. Active membrane peptides play key roles in the defense system of various organisms and to decipher the mechanisms how these biomolecules act when inserted into lipid bilayers, for example in the development of safe and efficient therapies against degenerative diseases. This way, we take advantage of the natural spectroscopic characteristics of both molecules to be used in UV/vis absorption techniques, Electronic and Magnetic Circular Dichroism, Electronic Paramagnetic Resonance and Nuclear Magnetic Resonance, aided by thermodynamic and fluorescence techniques, in order to explore the interaction of light with matter, without interference from external probes, focusing on changes in structure and orientation, in the most varied forms of interaction between biological systems molecules.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3130.pdf: 1560393 bytes, checksum: 956158589ca7612292e905d81a005f93 (MD5) Previous issue date: 2010-06-09 / Universidade Federal de Sao Carlos / Clavulanic acid is a β-lactam substance with low antibiotic activity. Nonetheless, it is an important medicine which acts as a potent β-lactamase inhibitor. These enzymes catalyze the hydrolysis of β-lactam ring of antibiotics, leaving them without antibiotic action. It is industrially produced with submerged cultures of Streptomyces clavuligerus, a filamentous bacterium. Extraction and purification studies have shown a very clear and defined course, when it comes to the stages that precede precipitation and crystallization. The extraction processes with ultrafiltration membranes, with organic solvents and extraction in aqueous two-phase systems (ATPS) have been studied whereas purification has been studied for processes which involve ion exchange. However, there are few works related to clavulanic acid aqueous two-phase system extraction and they are not conclusive. The present study proposed utilizing the aqueous two-phase system (ATPS) to purify the clavulanic acid and re-extract it with ion exchange adsorption, which might provide information for further studies on coupled processes which operate continuously. The first technique evaluated to re-extract the clavulanic acid was the separation process with membranes, and its results showed a low separation between PEG and clavulanic acid. In a second step, the ion exchange chromatography technique with Amberlite IRA-400Cl and Streamline Q XL resins was used. It was evidenced by the ion exchange chromatography that the Amberlite IRA- 400Cl resin makes the process of re-extraction of clavulanic acid from the top phase possible and that the phosphate present in the top phase makes clavulanic acid adsorption difficult for both studied resins. Addition of ethanol, in order to precipitate the phosphate salts, made the re-extraction of clavulanic acid from the ATPS top phase by Streamline Q XL resin possible. The third step of the global process was the optimization of clavulanic acid extraction using the aqueous two-phase systems. The results showed that it is possible to obtain yields around 100% and a purification factor of 1.5 times for the clavulanic acid. Another characteristic analyzed was the clavulanic acid degradation velocity in the aqueous two-phase system; it was very high at the bottom phase which was rich in phosphate salts. Trials of continuous aqueous twophase system process were performed. This process was shown to be operationally viable. The set of results acquired in this study will allow the study and implementation xxv of a continuous process for the purification of clavulanic acid utilizing the aqueous twophase system. / O ácido clavulânico é uma substância β-lactâmica com fraca atividade antibiótica, porém é um importante fármaco agindo como um potente inibidor de enzimas β- lactamase. Estas enzimas que catalisam a hidrólise do anel β-lactâmico dos antibióticos, deixando os sem ação antibiótica. O ácido clavulânico é produzido industrialmente por culturas submersas da bactéria filamentosa Streptomyces clavuligerus. Os trabalhos referentes à extração e purificação têm mostrado uma direção bastante clara e definida no sentido das etapas envolvidas que precedem à precipitação e cristalização. Na linha de extração têm sido estudados os processos com membranas de ultrafiltração, processos de extração com solventes orgânicos e extração em sistemas de duas fases aquosas (SDFA), enquanto que a purificação tem sido estudada por processos envolvendo a troca iônica. No entanto, são poucos os trabalhos relacionados com a extração do ácido clâvulanico por sistema de duas fases aquosas, não sendo estes ainda conclusivos. No presente trabalho foi proposto utilizar o SDFA para purificar o ácido clavulânico e re-extraí-lo através da adsorção por troca iônica, fornecendo subsídios para futuros estudos de processos conjugados operando de forma contínua. A primeira técnica estudada para re-extração do ácido clavulânico do SDFA foi o processo de separação com as membranas de polisulfona de microfiltração e ultrafiltração operando em escoamento tangencial, cujos resultados mostraram baixa separação entre PEG e ácido clavulânico. Numa segunda etapa utilizou-se técnica de cromatografia de troca iônica com as resinas Amberlite IRA-400Cl e Streamline Q XL. Para cromatografia de troca iônica ficou evidenciado que a resina Amberlite IRA-400Cl possibilita o processo de re-extração do ácido clavulânico da fase de topo e que o fosfato presente na fase de topo dificulta adsorção do ácido clavulânico para ambas as resinas estudadas. Adição do etanol para precipitação dos sais de fosfato possibilitou a re-extração do ácido clavulânico da fase de topo do SDFA pela resina Streamline Q XL. Como terceira etapa do processo global foi realizada a otimização da extração do ácido clavulânico através dos sistemas de duas fases aquosas, os resultados mostraram que é possível obter rendimento próximo a 100% e um fator de purificação de 1,5 vezes para o ácido clavulânico. Outro fator analisado foi a velocidade de degradação do ácido clavulânico no sistema de duas fases aquosas; esta se mostrou bastante alta na fase de fundo rica em sais de fosfato. Os ensaios do processo do sistema de duas fases aquosas contínuo foram realizados, sendo que esse processo mostrou-se operacionalmente viável. O conjunto de xxiii resultados obtidos neste trabalho permitirão o estudo e implementação de um processo contínuo para a purificação do ácido clavulânico utilizando o sistema de duas fases aquosas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6133.pdf: 10637138 bytes, checksum: 64ada7d9f618d8563b1dbee6ecf9ca2f (MD5) Previous issue date: 2013-09-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / Due to owing to the nature of culture involving aerobic filamentous microorganisms, conventional aerated stirred-tank bioreactors using the Rushton turbine impeller are widely employed in order to achieve good mixing and oxygen mass transfer. However, this impeller presents disadvantages such as high power consumption, and generates higher shear in the medium, which can cause irreversible morphological changes in microorganisms, damaging the culture performance. In literature, impellers called "Elephant Ear" (EE), presented in down-flow (down-pumping) (EEDP) and up-flow (up-pumping) (EEUP) configurations, are indicated as suitable for cultivation of shear sensitive cells. However, this characteristic has never been demonstrated quantitatively. In the present study, the oxygen transfer and hydrodynamics parameters were evaluated and compared in a conventional aerated stirredtank bioreactor equipped with impellers as the classical impeller Rushton turbine (RT) and with EE in EEDP and EEUP modes. Firstly, prediction equations were obtained for quantifying the average shear rate (Ýav) in the different systems, as function of the operating conditions (600≤N≤1000 rpm and 0.40≤Ýavar≤1.2 vvm) and rheological properties of the pseudoplastic fluids (K and n), based on a methodology that uses the volumetric oxygen transfer coefficient as characteristic parameter. The values of Ýav obtained from the correlations for the RT impeller were within a range of values estimated from correlations of the literature, showing that the methodology utilized is valid. Based on correlations of Ýav and on results of power consumption, the energy dissipation and Kolmogorov micro-scale (micro eddy sizes) could be estimated. For non-Newtonian fluids, the RT and EEUP impellers generated micro-eddies with smaller sizes in the range from 45.0-127.0 and 80.6-123.7 μm, respectively, showing that the impellers RT and EEUP are more shear than EEDP impeller. Using the prediction equations of Ýav the effect of shear conditions in cultures of Streptomyces clavuligerus were evaluated in conventional bioreactor equipped with RT, EEDP and EEUP impellers at 800 rpm, 0.50 vvm and 30C. Profiles of the volumetric oxygen transfer coefficient and shear rate were obtained during the cultivation. The morphological changes resulted from shear conditions imposed for the different impellers were analyzed using image analysis technique. The RT and EEDP impellers imposed the highest oxygen transfer and smaller shear to the broth, respectively. The flow pattern generated by EE impellers was crucial at the beginning of the cultivation, and is highly beneficial when EEUP impeller were used, since it presented a controlled shear throughout the cultivation. The best cultivation condition for the clavulanic acid production was obtained using the EEUP impeller, which resulted in a maximum concentration of 453 mg/L and a consistency index K= 2.5 Pa.s0.27. The results suggested that the isolated hyphae are directly related to the K of the broth and clavulanic acid production. According to the rapid fragmentation of clumps and emergence of isolated hyphae, it was concluded that the RT impeller presents shear rates higher than the EEs impellers, since the size of branched and non-branched hyphae were smaller and in greater quantities. This fact shows an advantage in the EEUP impeller use in shear sensitive microorganism cultures that requiring high levels of oxygen, without affecting the process performance. This advantage is associated with the flow pattern generated for the EEUP impeller. / Devido à natureza dos caldos de cultivo envolvendo microrganismos filamentosos aeróbios, de modo de obter adequada transferência de oxigênio e homogeneização do meio são tradicionalmente empregados biorreatores convencionais tipo tanque agitado e aerado utilizando o impelidor turbina de Rushton. Porém, esse impelidor apresenta desvantagens tais como o alto consumo de energia e elevado cisalhamento imposto ao meio, que pode provocar mudanças morfológicas irreversíveis aos microrganismos, prejudicando o rendimento dos cultivos. Na literatura especializada são indicados os impelidores denominados orelha de elefante ou Elephant Ear (EE), nas configurações de escoamento descendente (down-pumping) (EEDP) e de escoamento ascendente (up-pumping) (EEUP), como adequados para cultivos de células sensíveis ao cisalhamento. No entanto, esta caraterística nunca foi demostrada quantitativamente. No presente trabalho foram avaliados e comparados parâmetros de transferência de oxigênio e hidrodinâmicos em biorreator convencional tipo tanque agitado e aerado, equipado com impelidores como a clássica turbina de Rushton (TR) e com EE nas configurações EEDP e EEUP. Inicialmente foram obtidas equações de previsão para a quantificação da velocidade de cisalhamento média (Ýav Ýav) nos diferentes sistemas em função da frequência de agitação do impelidor e vazão especifica de ar e das propriedades reológicas de fluidos pseudoplásticos, com base em metodologia que utiliza o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio como parâmetro característico. Valores obtidos de Ýav para o impelidor TR pelas correlações obtidas ficaram dentro de uma faixa de valores estimados por correlações de literatura validando a metodologia empregada. Com base nas correlações de Ýav e nos resultados de consumo de potência, pode-se quantificar a dissipação de energia e a microescala de Kolmogorov (tamanho de micro-turbilhões). Para fluidos não-Newtonianos, os impelidores TR e EEUP geraram os menores micro-turbilhões com tamanhos nas faixas de 45,0-127,0 μm e de 80,6-123,7 μm, respectivamente, mostrando serem esses impelidores mais cisalhantes que o impelidor EEDP. Também com base nas equações de previsão de Ýav, foram avaliadas as influências das condições de transferência de oxigênio e de cisalhamento em cultivos de Streptomyces clavuligerus visando a produção de ácido clavulânico em biorreator convencional com os impelidores TR, EEDP e EEUP a 800 rpm, 0,50 vvm e 30C. A partir das amostras coletadas ao longo dos cultivos, foram obtidos perfis de kLa e de Ýav. Foram acompanhadas as mudanças morfológicas decorrentes das condições de cisalhamento impostas pelos diferentes impelidores mediante a técnica de análise de imagens. Os impelidores TR e EEDP impuseram, respectivamente, maiores e menores transferências de oxigênio e condições de cisalhamento ao caldo. A eficiência do padrão de escoamento gerado pelos impelidores EEs foi crucial nas primeiras horas do cultivo, sendo altamente benéfico quando utilizado o impelidor EEUP, o qual apresenta um cisalhamento controlado ao longo do cultivo. A melhor condição de cultivo em função da produção de ácido clavulânico foi obtida utilizando o impelidor EEUP obtendo uma produção máxima de 453 mg/L e índice de consistência K=2,5 Pa.s0,27. Os resultados sugerem que a quantidade de hifas isoladas está diretamente relacionada com o K do caldo e a produção de ácido clavulânico. De acordo com a rápida fragmentação de clumps e surgimento de hifas isoladas, conclui-se que o impelidor TR cisalha mais que os impelidores EE, isto é, pelos tamanhos das hifas ramificadas e não ramificadas que foram geradas em maiores quantidades e em menores dimensões. Tal fato mostra uma vantagem no uso do impelidor EEUP em cultivos de microrganismos sensíveis ao cisalhamento, e que necessitam de níveis superiores de oxigenação, não prejudicando o desempenho do processo. Estes resultados sugerem essa vantagem está associada ao padrão de escoamento imposto pelo impelidor EEUP.

As técnicas espectroscópicas utilizam a interação entre luz e matéria como forma de obter informações das características moleculares de um sistema. Os diversos níveis de energia manifestam-se em bandas espectrais que ao serem interpretadas fornecem características sobre estrutura, orientação e interações a nível molecular. O presente trabalho explorou as diversas facetas espectroscópicas, aliadas a técnicas biofísicas/bioquímicas, no intuito de compreender melhor dois tipos de biomoléculas importantes para a maquinaria dos seres vivos: proteínas e peptídeos. O citocromo P450 é uma enzima do tipo monooxigenase e constitui uma das maiores superfamílias de proteínas. Essa hemoproteína foi assim nomeada devido à sua característica absorção na região da Banda de Soret (450 nm), sendo esta uma particularidade natural muito utilizada em estudos por espectroscopia. Além disso, existe interesse de estudar esta família de proteínas em virtude de suas variadas funções metabólicas e biossintéticas, nos mais diversos organismos, como catalisação de esteróides, ácidos graxos, fármacos, carcinógenos químicos e metabólitos de plantas. Em especial, para a P450 de Streptomyces clavuligerus (P450CLA), ainda não se sabe ao certo como e com quais moléculas interage, e como funciona o mecanismo utilizado pela proteína para atuar em vias de síntese como a do ácido clavulânico, importante composto terapêutico. Paralelo ao paradigma de interação de uma proteína e potenciais ligantes, o entendimento dos mecanismos de interação entre peptídeos e membranas lipídicas também são de suma importância para uma melhor compreensão dos sistemas biomoleculares. Peptídeos ativos na membrana desempenham funções fundamentais no sistema de defesa de diversos organismos e decifrar os mecanismos de como essas biomoléculas agem quando inseridas em bicamadas lipídicas pode auxiliar, por exemplo, no desenvolvimento de terapias seguras e eficientes contra doenças degenerativas. Desta forma, aproveitamos as características espectroscópicas naturais de ambas as moléculas para serem empregadas em técnicas de absorção UV/vis, Dicroísmo Circular Eletrônico e Magnético, Ressonância Paramagnética Eletrônica e Ressonância Magnética Nuclear, auxiliados por técnicas termodinâmicas e de fluorescência, de modo a explorar a interação da luz com a matéria, sem interferências de sondas externas, dando enfoque às alterações de estrutura e orientação, nas mais variadas formas de interação entre moléculas de sistemas biológicos. / Spectroscopic techniques use the interaction between light and matter as a way for obtaining information about molecular characteristics of a system. The many energy levels manifest themselves in spectral bands, which when are interpreted, it provides characteristics about structure, orientation and interactions at the molecular level. The present study explored the various spectroscopic facets, allied to biophysical/biochemical techniques, in order to understand better two important biomolecules types for living beings machinery: proteins and peptides. Cytochrome P450 is a monooxygenase-like enzyme and it belongs to one of the largest proteins superfamilies. The hemoprotein received this name due its unique spectral absorption in Soret Band region (450 nm), a natural particularity widely used in spectroscopic studies. In addition, there is interest in studying this protein family by virtue of their several metabolic and biosynthetic functions in the most diverse organisms, such as steroids, fatty acids, drugs, chemical carcinogens and plant metabolites. In particular, regarding P450 from Streptomyces clavuligerus (P450CLA), it is still unclear how and which molecules it interacts with, and how the mechanism used by the protein to act in synthesis pathways such as clavulanic acid, an important therapeutic compound. Parallel to the interaction paradigm between proteins and potential ligands, the interaction mechanisms understanding between peptides and lipid membranes are also of paramount importance for a better understanding of the biomolecular systems. Active membrane peptides play key roles in the defense system of various organisms and to decipher the mechanisms how these biomolecules act when inserted into lipid bilayers, for example in the development of safe and efficient therapies against degenerative diseases. This way, we take advantage of the natural spectroscopic characteristics of both molecules to be used in UV/vis absorption techniques, Electronic and Magnetic Circular Dichroism, Electronic Paramagnetic Resonance and Nuclear Magnetic Resonance, aided by thermodynamic and fluorescence techniques, in order to explore the interaction of light with matter, without interference from external probes, focusing on changes in structure and orientation, in the most varied forms of interaction between biological systems molecules.

O ácido clavulânico é um potente inibidor de β-lactamases utilizado como terapêutico em associação à amoxicilina. O processo industrial de obtenção envolve o cultivo bacteriano em processo descontínuo, enquanto que a sua purificação é realizada, principalmente, por processos de extração líquido-líquido com solventes orgânicos e etapas cromatográficas. Assim, métodos alternativos como a purificação empregando sistemas micelares de duas fases aquosas (SMDFA), os quais oferecem um ambiente hidrofóbico e hidrofílico que possibilita seletividade na partição de biomoléculas de acordo com sua hidrofobicidade, são de grande interesse. Neste trabalho estudou-se a viabilidade da utilização de sistema micelar misto (não-iônico/aniônico) de duas fases aquosas formados pelos tensoativos não-iônico Triton X-114 e aniônico AOT na extração do ácido clavulânico proveniente de cultivo submerso de Streptomyces clavuligerus em processo descontínuo. A estabilidade do ácido clavulânico em relação ao pH, sais e suas concentrações, temperatura e aos tensoativos foi investigada visando limitar as regiões a serem estudadas nas extrações. Determinou-se ainda o ponto névoa dos sistemas Triton X-114/Tampão e Triton X-114/AOT/Tampão em diferentes condições, bem como, estudos de migração da biomolécula para as fases e do tempo necessário para o equilíbrio do sistema. A partir destas investigações iniciais, foram definidos os níveis das variáveis: concentração de AOT (0,50, 0,75 e 1,00 mM), Triton X-114 (1, 3 e 5% m/m), NaCl (0, 0,05 e 0,10 M) e temperatura (24, 26 e 28°C), cujas influências sobre o coeficiente de partição (KAC) e recuperação da biomolécula na fase diluída (nAC) foram investigadas através de um planejamento fatorial. A análise estatística e o modelo matemático obtido a partir dos resultados para KAC revelou ser possível obterem-se KAC≈ 1,65 e nAC≈ 71,58%. No entanto, a análise estatística empregando nAC como resposta apontou condições experimentais desprovidas de significado físico-químico. Em experimentos seriados realizados com Triton X-114 3% m/m, Tampão Mcllavine pH 6,5 e adição gradual de AOT, um aumento da concentração deste tensoativo levou a maiores KAC e Balanço de massa (BMAC)≈ 85%. Desta forma é possível concluir que o sistema micelar misto de duas fases aquosas proporciona baixa perda da biomolécula e partição para a fase diluída, que é uma vantagem devido a menores problemas em uma etapa subsequente de purificação. / Clavulanic acid is a potent inhibitor of β-lactamases that is used as a therapeutic in conjunction with amoxicillin. Its industrial process of production involves bacterial growing in a batch process, while its purification is carried out mainly by process of liquid-liquid extraction with organic solvents and chromatographic steps. Thus, alternative methods like the purification employing two-phase aqueous micellar systems, which offer both hydrophobic and hydrophilic environments to solute species and allow selectivity in partitioning depending on the hydrophobicity of biomolecules, are of great concern. This work studied the feasibility of using two-phase aqueous mixed (nonionic/anionic) micellar systems formed by nonionic surfactant Triton X-114 and anionic surfactant AOT to extract clavulanic acid from broths fermented by Streptomyces clavuligerus in batch process. The stability of clavulanic acid at different values of pH, salts and their concentration, temperature and in the presence of different surfactants was investigated so as to limit the areas to be submitted to further studies. The cloud-point of the systems Triton X-114/Buffer and Triton X-114/AOT/Buffer was also determined under different conditions, and studies were performed on partitioning the biomolecule between the phases and the time needed to balance of the system. From these initial investigations the following levels of the variables were defined: concentration of AOT (0.50, 0.75, and 1.00 mM), Triton X-114 (1, 3 and 5% w/w), NaCl (0, 0.05 and 0.10 M) and temperature (24, 26 and 28°C), whose influences on the partition coefficient (KCA) and yield in the top phase (nCA) were investigated using factorial design. Statistical analysis and the mathematical model derived from the results allowed obtaining KCA≈ 1.65 e nCA≈ 71.58%. However, the statistical analysis using the response nCA indicated experimental conditions devoid of any physico-chemical meaning. In serial experiments performed with Triton X-114 3% w/w, Mcllvaine buffer at 6.5 pH and gradual addition of AOT, an increase in the concentration of anionic surfactant led to higher KCA and mass balance (BMCA≈ 85%). Thus, is possible conclude that the two-phase aqueous mixed micellar system provides low loss and partition to dilute phase, which is an advantage because it implies less problems in a subsequent step of purification.