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Factor VIII is a complex of two proteins, the von Willebrand factor (or factor VIII related antigen) and the procoagulant protein. Both are essential for normal haemostasis. Problems exist in the purification of factor VIII as it is present in only low concentrations in plasma, and its procoagulant activity is unstable. As a result, therapeutic factor VIII concentrates prepared by the Blood Transfusion Service (for the treatment of heamophilia and von Willebrand's disease) are relatively impure, and the yield from existing purification processes is low. The studies presented in this thesis are aimed towards increasing the quality and yield of therapeutic concentrates. Attention has been focussed on improving methods for the purification and assay of factor VIII. Novel affinity purifications reagents for factor VIII have been studied, and methods for removing the major impurity (fibrinogen) from conventional factor VIII concentrates have been investigated. The factor VIII related antigen (FVIIIR:Ag) and the procoagulant antigen (FVIII:CAg) have been purified, and used as immunogens for the production of specific antibodies. A large volume of polyclonal antibody to FVIIIR:Ag has been produced in sheep. This was subsequently used to develop an immunopurification method for FVIII:CAg. Immunisation of mice with purified FVIII:CAg gave a valuable panel of ten monoclonal antibodies to procoagulant factor VIII. These have important applications in the assay, purification and biochemical study of this protein. Sensitive radiometric assays for FVIIIR:Ag and FVIII:CAg have been established. This work involved the development of methods for the preparation of ¹²⁵I-FVIIIR:Ag, and for the purification and labelling of human anti-FVIII:CAg Fab' fragments from inhibitor plasma. An artificial factor VIII-deficient substrate has been prepared on a large scale for the one-stage bioassay of procoagulant activity (FVIII:C).

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Effect of added calcium ions on the relative milk clotting activities of porcine pepsin, Mucor miehei protease, Endothia parasitica protease, and Mucor pusillus protease was compared with that of rennin. Skimmilk, maintained at pH 6. 3 with 0.000% to 0.030% added calcium chloride, was used as a substrate. The coagulation activity of Mucor pusillus protease appeared to be most sensitive to calcium ions, followed by Mucor rniehei protease, porcine pepsin, rennin, and Endothia parasitica protease. The clotting activities of Mucor pusillus protease were also more sensitive than rennin to added calcium ions in milk samples maintained at pH values of 6.4, 6.5, and 6.6. Mucor pusillus protease and rennin were standardized to equal activities in skimmilk maintained at pH 6.3 and 6.6 containing 0.020% added CaCl2. For skimmilk maintained at pH 6.3, Mucor pusillus protease concentrations ix that gave the same clotting times as rennin in skimmilk containing 0.000% and 0.010% added CaCl2, were 9.6% and 4.5% higher than its standardized concentration. While at pH 6.6 Mucor pusillus protease concentrations were 13.2% and 5.8% higher.

Die vorliegende Arbeit untersucht die strukturellen Grundlagen agonistischer und invers agonistischer Eigenschaften von Liganden am ADP-Rezeptor P2Y12. Dazu wurde eine Bibliothek systematisch veränderter Purinverbindungen am Wildtyp-P2Y12 (WT) mit und ohne ADP und an 28 konstitutiv aktiven P2Y12-Mutanten getestet. Dies ermöglichte die pharmakologische Zuordnung der Substanzen als Agonist, Antagonist oder inverser Agonist. Die Untersuchungen wurden in einem Hochdurchsatz-Hefe-Expressionssystem in Hefen durchgeführt. Als agonistische Liganden am P2Y12 Rezeptor konnten verschiedene ATP und ATP-Derivate identifiziert werden. Ihre agonistische Potenz am ADP-Rezeptor reihte sich wie folgt: 2-(methylthio)-ADP > 2-(methylthio)-ATP > ADP > ATP. In Dockingstudien wurde mittels eines komparativen Computermodels des P2Y12 für diese ATP-Derivate eine Bindungsstelle nachgewiesen, die von den Transmembrandomänen (TM) 3, 5, 6 und 7 gebildet wird. Die Aminosäuren Y105, E188, R256, Y259 und K280 besitzen in der Ligandeninteraktion einen besonderen Stellenwert. Zudem konnten einige Liganden identifiziert werden, die invers agonistische Eigenschaften an konstitutiv aktiven P2Y12-Mutanten zeigten. So führte eine N-Methyl-anthraniloyl-(mant) Modifizierung an der 3’-OH Gruppe der 2’-Deoxyribose (mant-dATP, mant-dADP) zu Liganden mit invers agonistischen Eigenschaften an 10 konstitutiv aktiven P2Y12-Mutanten. Diese Wirkung konnte mittels verschiedener funktioneller Tests in Säugerzellsystemen ebenfalls für den WT-Rezeptor bestätigt werden. Basierend auf den Ergebnissen computerassistierter Dockingstudien schienen inverse Agonisten und Agonisten dieselbe Bindungstasche zu nutzen. Eine mechanistische Erklärung für ihren funktionellen Unterschied am WT konnte das Modell jedoch nicht liefern. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass der als ADP-Rezeptor bezeichnete P2Y12 mit einer etwas geringeren Potenz auch ATP als natürlichen Agonist erkennt und dass mant-modifiziertes dATP und dADP neue inverse Agonisten mit potenziellem therapeutischem Nutzen sind.