Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-01T18:44:35Z No. of bitstreams: 1 Tese - Elisa B. Leon.pdf: 1932561 bytes, checksum: 5e6100c77314d1d21141bf03a3e5585b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-01T18:44:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Elisa B. Leon.pdf: 1932561 bytes, checksum: 5e6100c77314d1d21141bf03a3e5585b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-01T18:45:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Elisa B. Leon.pdf: 1932561 bytes, checksum: 5e6100c77314d1d21141bf03a3e5585b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-01T18:45:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Elisa B. Leon.pdf: 1932561 bytes, checksum: 5e6100c77314d1d21141bf03a3e5585b (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Background: Immunologic and skeletal muscle morphology changes are associated with functional capacity impairment after myocardial infarction (MI), added central modifications. A better understanding of the hemodynamic and peripheral mechanism involved in heart failure is necessary to develop specific therapeutic strategies, as stem cells (SC) or granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) to slow or prevent muscular atrophy present in this syndrome beyond the deleterious immunologic changes. Aims: Therefore, the purpose of this study was to evaluate the effects of stem cells (SC) or/and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) administration into heart and peripheral tissues after experimental myocardial infarction induction. Methods: In Balb/C was induced ligation of the left coronary artery. Animals in the control group underwent the surgical procedure without ligation of the artery. One week after the procedure, animals were treated with PBS (IM+PBS), G-CSF (IM+G-CSF) or G-CSF associated with hematopoietic CT (IM+G-CSF+CT). The animals were observed for a period of four weeks and underwent echocardiography, stress testing and collection of tissues (heart, lung, diaphragm, liver and peripheral muscle) for analysis of cytokines and structural changes. Results: The results demonstrate that all the treatments were able to reduce infarct, more evident following administration of G-CSF. Moreover, G-CSF induced response in the worst stress test (smaller total distance and final velocity achieved). Analysis of cytokines skeletal tissue demonstrated increased frequency of high producers of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-6, IL-12, IFN-γ, IL-1-β and IL-4 in mice infarcted, resulting in imbalance in balance anti/pro-inflammatory immune response. The treatments had impaired negative when using G-CSF alone and satisfactory results when combined with the use of SCs. Conclusion: We conclude that using G-CSF alone appears to be responsible for amplifying the inflammatory process in infarcted animals leading to reduced functional capacity of skeletal muscle, which reflects in lower performance in exercise stress testing. In contrast, the use of G-CSF in association with hematopoietic CT appears to have a beneficial effect in modulating the inflammatory response and result in lower deleterious effect on the heart failure syndrome. / Introdução: Alterações imunológicas e morfológicas na musculatura esquelética são associadas com piora da capacidade funcional após infarto do miocárdio, somado às modificações centrais. Um melhor entendimento dos mecanismos centrais e periféricos envolvidos na insuficiência cardíaca é necessário para desenvolvimento de estratégias terapêuticas específicas, como a utilização de células tronco (CT) ou fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF) para diminuir ou prevenir atrofia muscular presente nesta síndrome, além das mudanças imunológicas deletérias. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da administração de células tronco ou/e fator estimulador de colônia de granulócitos nas modificações cardíacas e mudanças teciduais periféricas após a indução de infarto do miocárdio experimental. Metodologia: Em camundongos Balb/C foi induzida a ligadura da artéria coronária esquerda. Os animais do grupo Controle foram submetidos ao procedimento cirúrgico sem a ligadura da artéria. Uma semana após o procedimento, os animais foram submetidos a tratamento com PBS (IM+PBS), G-CSF (IM+G-CSF) ou G-CSF associado à CT hematopoética (IM+GCSF+ CT). Os animais foram observados por um período de quatro semanas, sendo então realizada análise ecocardiográfica, teste de esforço e coleta de tecidos (coração, pulmão, diafragma, fígado e músculo periférico) para análise de citocinas e mudanças estruturais. Resultados: Os resultados demonstram que todos os tratamentos propostos foram capazes de diminuir a área de infarto, de maneira mais evidente após a administração de G-CSF. Por outro lado, o G-CSF induziu a pior resposta no teste de esforço (menor distancia total percorrida e velocidade final alcançada). A análise das citocinas teciduais esqueléticas demonstrou aumento da frequência de altos produtores de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-6, IL-12, IFN-γ, IL1-β e IL-4 em camundongos infartados, resultando em desequilíbrio no balanço anti/pró-inflamatório da resposta imune. Os tratamentos propostos apresentaram comprometimento negativo durante o uso de G-CSF isolado e resultados satisfatórios quando associado ao uso das CTs. Conclusão: Concluiu-se que a utilização de G-CSF sozinho parece ser responsável por ampliar o processo inflamatório em animais infartados conduzindo a uma diminuição da capacidade funcional do músculo esquelético, o qual reflete em desempenho inferior no teste de esforço. Em contraste, a utilização de G-CSF, em associação com CT hematopoiéticas parece ter um efeito benéfico no processo inflamatório modulando a resposta e refletindo em menor efeito deletério na síndrome da insuficiência cardíaca.

The granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is a hematopoietic cytokine that stimulates and regulates the proliferation and differentiation of neutrophil precursor cells of the bone marrow. The recombinant hormone (rhG-CSF) non-glycosylated, filgrastim, is used to treat the neutropenia induced by chemotherapy and bone marrow transplantion. The identification and characterization was carried out by electrophoresis and western blotting, showing the typical band in the region of 18.8 kDa. The neutropenia mouse bioassay was standardized with the BALB/c strain, previously treated with ifosfamide and used for the potency assessment of pharmaceutical products. A gradient reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) was validated for the analysis of rhG-CSF in pharmaceutical formulations. The LC method was carried out on a Jupiter C4 column 300 Å (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at ambient temperature. The mobile phase A consisted of water:acetonitrila (90:10, v/v) with 0.1% trifluoroacetic acid and the mobile phase B was water:acetonitrile (20:80, v/v) with 0.1% trifluoroacetic acid, run at a flow rate of 0.5 mL/min with detection at 280 nm. The chromatographic separation was obtained with the retention time of 31.9 minutes and the method was linear in the range of 10 300 μg/mL. Validation parameters such as sensitivity, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness were evaluated giving results in the acceptable range. The specificity was evaluated by the peak purity of the rhG-CSF biological reference preparation subjected to oxidative conditions. The proposed method was applied for the analysis of filgrastim pharmaceutical products, evaluating the sulphoxides and deamidates forms as well. Moreover, the size-exclusion chromatography (SE-LC) was performed for the potency evaluation of 7 filgrastim, dimers and high-molecular-mass forms. Samples of pharmaceutical formulations were subjected to aggregation, degradation and than each one evaluated by the neutropenia mouse bioassay giving biological activities of 14.60%, 13.47% and 15.63%, for the dimers, high-molecular-mass substances and the sulphoxides/deamidates, respectively. The pharmaceutical samples were analysed by the chromatographyc methods and compared to the bioassay showing mean difference between the estimated potencies of 2.04% lower for the RP-LC, and 4.03% lower for the SE-LC, with significant correlation (p>0.05). Due to the reduced bioactivity of the rhG-CSF-related proteins, the SE-LC is proposed in combination with the RP-LC as an alternative to the bioassay for the potency assessment of filgrastim in pharmaceutical dosage forms. The alternative established represents a contribution towards the replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / O fator estimulador da colônia de granulócitos humanos é uma citocina hematopoiética que estimula e regula a proliferação e diferenciação de células precursoras de neutrófilos da medula óssea. O hormônio recombinante (rhG-CSF) sob a forma nãoglicosilada, filgrastima, é usado para o tratamento de neutropenias. Realizou-se a identificação de filgrastima em produtos farmacêuticos por eletroforese, transferência e detecção com anticorpos específicos, demonstrando-se banda única na região de peso molecular de, aproximadamente, 18,8 kDa. Avaliou-se a atividade pelo ensaio biológico da neutropenia em camundongos da linhagem BALB/c, pré-tratados com ifosfamida. Desenvolveu-se e validou-se o método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), utilizando coluna Júpiter C4 300 Å (250 mm x 4,6 mm, i.d.), mantida a temperatura ambiente. A fase móvel A foi constituída de água/acetonitrila (90:10, V/V)/ 0,1% ácido trifluoroacético e a fase móvel B de água/acetonitrila (20:80, V/V)/ 0,1% ácido trifluoroacético, eluída em gradiente na vazão de 0,5 mL/min com detecção no ultravioleta a 280 nm. A análise cromatográfica viabilizou a separação da filgrastima no tempo de retenção de 31,9 min, sendo linear na faixa de concentração de 10 300 μg/mL. Avaliaram-se os parâmetros de precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Estudou-se também a especificidade, através da determinação da pureza do pico da Substância biológica de referência de rhG-CSF, submetida à degradação sob condições oxidativas. O método proposto foi utilizado para análise de filgrastima em produtos farmacêuticos, determinando-se as formas de sulfóxidos e desamidados. Paralelamente, efetuaram-se avaliações de potência por cromatografia líquida por exclusão molecular (CL-EM), determinando as formas diméricas e de alta massa molecular. Amostras de produtos farmacêuticos foram submetidas a condições de agregação e degradação e, então, avaliadas pelo bioensaio da neutropenia em 5 camundongos, obtendo-se atividades biológicas de 14,60%, 13,47% e 15,63%, para os dímeros, substâncias de alta massa molecular e sulfóxidos/desamidados, respectivamente. Estudou-se a correlação entre métodos e demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias 2,04% menor por CL-FR, e significativa de 4,03% menor por CL-EM, em relação ao ensaio biológico. Devido à reduzida bioatividade das formas alteradas, conclui-se sugerindo a adoção do método por CL-EM para a avaliação de potência de filgrastima, em combinação com CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) is a cytokine that regulates the proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells and activates mature granulocytes and macrophages. Clinically is used in enhancing hematopoietic recovery after cancer chemotherapy and bone marrow transplantation. A reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was validated for the determination of the non-glycosylated recombinant rhGM-CSF (Molgramostim) in biopharmaceutical formulations. The RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 45 ºC. The mobile phase A consisted of 0.1% TFA and the mobile phase B consisted of 0.1% TFA in acetonitrile, run at a gradient from: 0.01 34 min, 37% 50% of B; 34 35 min linear back to 37% of B and 35 40 min, 37% of B. The flow rate was 1 mL/min, and using photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The chromatographic separation was obtained with the retention time of 29.2 min, and was linear over the concentration range of 2-300 μg/mL (r2 = 0.9992). The procedure was validated evaluating parameters such as the specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, limit of detection and limit of quantitation. The specificity was proven through degradation studies, showing that also there was no interference of the excipients. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of the degraded products showed significant differences (p<0.05). The proposed method was applied for the analysis of molgramostim and their related proteins, and the results were correlated to the bioassay, showing mean differences of the potency 1.02% higher for the RP-LC method, contributing to establish alternatives to characterize and monitoring its instability, improving the quality control and assuring the therapeutic efficacy. / O fator estimulador da colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) é uma citocina que regula a proliferação e diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas e ativa granulócitos e macrófagos maduros. É clinicamente indicado após quimioterapia para o câncer e após transplante de medula óssea. No presente trabalho foi validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para a avaliação da molgramostima, forma recombinante não-glicosilada do GM-CSF, em formulação biofarmacêutica. Utilizou-se coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 45 °C. A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B de ácido trifluoracético 0,1% em acetonitrila, eluídas no gradiente: 0,01 34 min, 37 50% de B; 34 35 min, 50 37% de B, mantendo-se nesta proporção até 40 min. Utilizou-se vazão de 1 mL/min, usando detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 29,2 min, sendo linear na faixa de concentração de 2 300 μg/mL (r2 = 0,9992). O procedimento foi validado, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez, limite de detecção e quantificação. A especificidade foi comprovada através de estudos de degradação, demonstrando também que não houve interferência dos excipientes. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro dos produtos degradados que apresentaram diferença significativa (p<0,05). O método foi aplicado para avaliação de potência de molgramostima e de proteínas relacionadas, e os resultados foram correlacionados com o bioensaio, observando-se diferenças médias de potência 1,02% superiores por CL-FR. Contribuiu-se assim para o estabelecimento de alternativas que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is a hematopoietic cytokine that stimulates and regulates the proliferation and differentiation of neutrophils precursors cells of the bone marrow. The recombinant hormone (rhG-CSF) non-glycosylated, filgrastim, is used to treat the neutropenia induced by chemotherapy and bone marrow transplantation. The hydrophobic protein is a 175 aminoacids chain which contains an extra methionine at its N-terminus, and molecular weight of 18.8 kDa. In the present study, a capillary zone electrophoresis (CZE) method was developed and validated for the analysis of filgrastim in pharmaceuticals. The analyses were performed on a fused-silica capillary (75 μm i.d.; effective length, 72 cm) and background electrolyte consisted of 50 mM sodium tetraborate solution at pH 9.0. The capillary temperature was maintained at 15 °C and the applied voltage was 15 kV. The injection was performed using the hydrodynamic mode at 50 mbar for 6 s, with detection at 195 nm using a PDA detector. The electrophoretic separation was obtained with migration time of 21.8 and 15.8 minutes for the filgrastim and leuprorrelin acetate (internal standard), respectively, and with run time of 30 minutes. The procedure was validated by the parameters of specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, limit of quantitation and limit of detection. The method was linear in the concentration range of 1 200 μg/mL (r2 = 0.9978) and the limit of quantitation (LOQ) was 1 μg/mL, with acceptable validation parameters. The method was applied for the analysis of pharmaceutical formulations, and the results were correlated to the reversed-phase HPLC method (RP-HPLC), size-exclusion HPLC method (SE-HPLC) and in vitro bioassay method. Therefore, the procedures represent valid alternatives which can improve the quality control, assuring the safety and therapeutic efficacy of the biological product. / O fator estimulador da colônia de granulócitos humanos é uma citocina hematopoiética que estimula e regula a proliferação e diferenciação de células precursoras de neutrófilos da medula óssea. O hormônio recombinante (rhG-CSF) sob a forma não-glicosilada, filgrastima, é usado para o tratamento de neutropenia induzida por quimioterapia e transplante de medula óssea. A proteína hidrofóbica é constituída por uma cadeia de 175 aminoácidos com uma metionina N-terminal, e massa molecular de 18,8 kDa. No presente estudo, foi desenvolvido e validado método por eletroforese capilar de zona (CZE) para determinação de filgrastima em formulações farmacêuticas. As análises foram realizadas em capilar de sílica fundida (comprimento efetivo de 72 cm e diâmetro interno de 75 μm) e solução eletrolítica composta de tetraborato de sódio 50 mM, pH 9,0. O capilar foi mantido a temperatura de 15 °C, e a tensão aplicada foi de 15 kV. O tempo de injeção foi de 6 s, com pressão de 50 mbar, e detecção por arranjo de diodos (DAD) a 195 nm. A separação eletroforética foi obtida com tempo de migração de 21,8 e 15,8 minutos para filgrastima e acetato de leuprorrelina (padrão interno), respectivamente, e tempo total de corrida de 30 minutos. O procedimento foi validado, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez, limite de quantificação e limite de detecção. Demonstrou-se linearidade na faixa de concentração de 1 200 μg/mL (r2 = 0,9978) e limite de quantificação (LQ) de 1 μg/mL, com os demais parâmetros de validação aceitáveis. O método foi aplicado para análise de formulações farmacêuticas, e os resultados foram correlacionados com os obtidos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CLEM), e pelo bioensaio in vitro. Deste modo, os procedimentos pesquisados contribuem para o estabelecimento de alternativas que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.