Les colicines sont des toxines protéiques sécrétées par Escherichia coli ou des espèces apparentées. Leur mécanisme d'action se décompose en plusieurs étapes impliquant des domaines structurellement distincts de la toxine : le domaine central interagit avec un récepteur spécifique de membrane externe, le domaine N-terminal est transloqué à travers la membrane externe via un translocateur, puis transite dans le périplasme et le domaine C-terminal porte l’activité létale. L’étape de transit des colicines dites du groupe A implique l'interaction du domaine N-terminal de la colicine avec les protéines du système Tol. Ce système est formé de cinq protéines : TolQ, TolR, TolA, TolB et Pal. Le système TonB, composé des protéines TonB, ExbB et ExbD, est quant à lui parasité par les colicines dites du groupe B. La combinaison de techniques in vivo et in vitro, nous a permis de mettre en évidence pour la première fois l’interaction d’une colicine avec la protéine TolQ. Nous avons également montré que le clivage protéolytique de la protéine TolA, une protéine clé du système Tol, contrôle les interactions séquentielles engagées entre les colicines du groupe A et les composants de leur machinerie d’import chez E. coli. La colicine interagit avec TolB, puis TolA et finalement avec TolR et/ou TolQ. Nous avons également pu attribuer un rôle à la protéase FtsH dans ce mécanisme de dégradation. Parallèlement, nous avons entrepris de caractériser la colicine TonB-dépendante appelée colicine M (ColM), la seule colicine connue à ce jour capable de perturber la synthèse de peptidoglycane et dont l’activité nécessite la présence de la protéine périplasmique FkpA, un chaperon possédant une activité peptidyl-prolyl isomérase. Nous avons proposé une nouvelle approche pour étudier la ColM et délimiter plus précisément ses domaines afin d’identifier la séquence minimale requise pour sa toxicité. Nous avons montré que dans E. coli, la production périplasmique de la ColM (sp-ColM) est toxique et que son activité dépend de FkpA. Le domaine minimal requis pour cette toxicité correspond aux 153 derniers acides aminés C-terminaux deColM. Contrairement à la ColM entière, la toxicité de ce domaine C-terminal dans le périplasme d’ E. coline requiert pas FkpA.L’ensemble des données montrent que les colicines sont capables de parasiter des systèmes bactériens pour pénétrer dans la cellule et aussi de détourner la fonction physiologique de certaines protéines pour atteindre leurs cibles. / Colicins are toxin proteins secreted by Escherichia coli or related bacteria species. The actionmechanism of the colicins can be divided into several steps that involve distinct structural domains: thebinding of its central domain to an outer membrane specific receptor, the translocation of its N-terminaldomain through the outer membrane, the transit of this same domain through the periplasm and the lethalactivity carried by the C-terminal domain. The transit step of the group A colicins requires the interactionof colicin N-terminal domain with the Tol system which is composed of five proteins: TolQ, TolR, TolA,TolB and Pal. The TonB system, composed of TonB, ExbB and ExbD, is parasitized by the group Bcolicins. Using a combination of in vitro and in vivo experiments, we identified for the first time aninteraction between a colicin and the TolQ protein. We have also shown that the proteolytic cleavage ofthe TolA protein, a key protein of the Tol system, controls the sequential interactions of the group Acolicins with the components of their import machinery in E. Coli and we assigned a role to FtsH proteasein this degradation mechanism. We defined that the colicin interacts first with the TolB protein, then withTolA, and finally with TolR and/or TolQ.In parallel, we undertook the characterization of the TonB-dependent colicin M (ColM), the only colicinknown to be able to disrupt the peptidoglycan synthesis and that requires for its toxic activity the presenceof FkpA, a chaperone and peptidyl propyl isomerase protein located in the periplasm. We proposed a newapproach to investigate the in vivo activity of ColM designed to identify the different domains of ColMand the minimal sequence that retains toxic activity. We have shown that in E. coli, the periplasmicproduction of ColM is toxic and that its activity is FkpA dependent. The minimal domain required fortoxicity corresponds to the C-terminal last 153 amino acids of ColM. Unlike the full-length protein, thisdomain produced in the E. coli periplasm does not require FkpA for toxic activity.All these data show that colicins are able to parasitize bacterial systems to enter the cell and also to divertthe physiological function of certain proteins to achieve their targets

L’émergence de bactéries multirésistantes aux antibiotiques est la conséquence de leur utilisation à mauvais escient au cours de ces dernières décennies. Ce phénomène constitue un problème de santé publique majeur, et face à cette urgence sanitaire, il est nécessaire de trouver rapidement de nouveaux agents antibactériens.Les colicines, au regard de leurs propriétés antimicrobiennes intrinsèques, constituent des candidats intéressants. Naturellement produites par E. coli dans le but de tuer des souches compétitrices de la même espèce ou d’espèces apparentées, elles exercent en général leur activité cytotoxique par le biais d’une activité ionophorique ou nucléasique. Parmi les nombreuses colicines connues à ce jour, la colicine M (ColM) est la seule à interférer avec la voie de biosynthèse du peptidoglycane, macromolécule essentielle et spécifique au monde bactérien. En effet, une fois dans le périplasme de E. coli, la ColM clive le lipide II, dernier précurseur de la voie de biosynthèse du peptidoglycane, conduisant de ce fait à la lyse bactérienne. Plusieurs homologues de la ColM ont été identifiés chez d’autres genres bactériens (Pseudomonas, Pectobacterium et Burkholderia) mais aucune cytotoxicité croisée n’a été mise en évidence à ce jour, d’où un spectre d’action restreint pour les membres de cette nouvelle famille d’enzymes antibactériennes.Ce travail traite de l’étude structurale et biochimique de la ColM et de certains de ses homologues. L’étude structurale de différents variants de la PaeM, homologue issu de P. aeruginosa, a permis d’identifier une molécule d’eau conservée au sein du site actif qui joue probablement un rôle central dans le mécanisme catalytique de cette famille d’enzyme. L’expression des homologues de la ColM issus de Pseudomonas et de Pectobacterium, directement dans le périplasme de E. coli, a permis de démontrer leur activité lytique, prouvant ainsi le grand potentiel de ces bactériocines en tant qu’alternatives aux antibiotiques. Enfin, la construction de plusieurs colicines chimères entre la ColM et ses homologues, capables de dégrader le lipide II in vitro et d’induire la lyse d’E. coli suite à leur expression périplasmique, ouvre la voie à de futurs espoirs thérapeutiques. / The misuse of antibiotics during the last decades led to the emergence of multidrug resistant pathogenic bacteria. This phenomenon constitutes a major public health issue. Given that urgency, the finding of new antibacterials in the short term is crucial.Colicins, due to their antimicrobials properties, constitute good candidates. They are protein toxins produced by E. coli to kill competitors belonging to the same or related species. In most cases, they exhibit their cytotoxic activity through an ionophoric or nucleasic activity. Among the twenty colicins known to date, colicin M (ColM) is the only one known to interfere with peptidoglycan biosynthesis. It develops its lethal activity in the E. coli periplasm, in three steps deeply linked to its structural organization in three domains. Once in the periplasm, ColM degrades the lipid II, i.e. the last precursor in the peptidoglycan biosynthesis pathway, in two products that cannot be reused, thereby leading to cell lysis. Several ColM homologues have been identified in other bacterial genera, such as Pseudomonas, Pectobacterium and Burkholderia, but no cross activity has been shown to date, explaining the narrow antibacterial spectrum displayed by the members of this new family of antibacterial enzymes.This work deals with the structural and biochemical study of ColM and some of its homologues. Structural studies on several variants of PaeM, the ColM homologue from P. aeruginosa, led to identify a conserved water molecule in the active site, probably playing a central role in the catalytic mechanism of this enzyme family. Moreover, expression of ColM homologues from Pseudomonas or Pectobacterium species directly in the E. coli periplasm showed that all these homologues were able to induce E. coli cell lysis, thus demonstrating the great potential of these bacteriocins as an alternative to antibiotics. Following these results, several chimera colicins were created between ColM and its homologues, which were shown to degrade lipid II in vitro and to induce E. coli cell lysis after their periplasmic expression, opening the way to future new therapeutic options.

Les colicines sont des toxines antibactériennes d’Escherichia coli qui sont relâchées par les cellules productrices (colicinogènes) dans le milieu extracellulaire en réponse à des conditions de stress environnementaux. Les colicines D et E3 sont des RNases qui clivent respectivement les tRNAArg et le 16S RNA ribosomique. Les deux colicines parvenues au cytoplasme de la cellule cible provoquent ainsi la mort par inactivation de la machinerie de biosynthèse des protéines. L’import de ces deux colicines nécessite d’abord le détournement de deux systèmes cellulaires différents (FepA/TonB ou BtuB/Tol) de leur fonction physiologique, permettant leur translocation à travers la membrane externe. L’idée que par la suite la translocation à travers la membrane interne nécessite au préalable une étape de processing des colicines nucléases est ancienne, mais elle n’a jamais été démontrée formellement. Nos travaux ont permis de montrer qu’une coupure endoprotéolytique des deux colicines constitue une étape de « processing » essentielle de leur action toxique. Nous avons détecté la présence du domaine C-terminal catalytique des deux colicines dans le cytoplasme des cellules cibles préalablement exposées à la toxine. Les mêmes fragments processés (PF) ont été identifiés dans les cellules sensibles et dans les cellules immunes contre ces colicines, qui sont protégées par une protéine d’immunité spécifique, formant un complexe neutre avec le domaine catalytique. Nous avons démontré que la protéase essentielle de la membrane interne, FtsH, est nécessaire au processing des deux colicines pendant leur import. Nous avons montré aussi que la signal-peptidase LepB, une autre enzyme essentielle de la membrane interne, interagit directement avec le domaine central de la colicine D in vitro et ainsi elle est un facteur protéique spécifiquement nécessaire au processing de la colicine D. Cependant ce n’est pas l’activité catalytique de LepB qui est impliquée dans la toxicité de la colicine D, mais elle jouerait un rôle structural. LepB ainsi faciliterait probablement l’association de la colicine D avec la membrane interne en vue de la reconnaissance de la toxine par FtsH. Nous avons aussi montré que la protéase OmpT de la membrane externe est responsable d’une coupure endoprotéolytique alternative, qui refléte probablement son rôle bien connu dans le système de défense des bactéries contre les peptides anti-microbiens. Même si cette coupure in vitro permet de libérer le domaine catalytique des colicines D et E3, il est établit maintenant que la protéase OmpT n’est pas impliquée dans le processing des colicines durant leur import dans le cytoplasme. / Colicins are antibacterial toxins of Escherichia coli that are released into the extracellular medium in response to environmental stress conditions. Colicin D is an RNase that cleaves the anticodon loop of all four isoaccepting tRNAArg. Colicin E3 cleaves 16 S ribosomal RNA. Both colicins provoke cell death by inactivating the protein biosynthetic machinery. Colicin producer cells are protected against both endogenous and exogenous toxin molecules by the constitutive expression of a cognate immunity protein, which forms a tight heterodimer complex with the nuclease domain of the colicin. The import of both colicins first requires the “hijack” of some distinct functions of the target cell (namely the BtuB/Tol and FepA/TonB systems, respectively), this allowing their translocation across the outer membrane. It has long been suggested that the import of nuclease colicins requires protein processing during the translocation across the inner membrane; however it had never been formally demonstrated. Our work shows that the two different RNase colicins E3 and D undergo a processing step inside the cell that is essential to their killing action. We have detected the presence of the C-terminal catalytic domains of these colicins in the cytoplasm of target bacteria. The same processed forms (PF) were identified in both colicin-sensitive cells and in cells immune to colicins, because of the expression of the cognate immunity protein. We demonstrate that the inner membrane protease FtsH is necessary for the processing of colicins D and E3 during their import. We also show that the signal peptidase LepB interacts directly with the central domain of colicin D in vitro and that it is a specific but not a catalytic requirement for in vivo processing of colicin D. The interaction of colicin D with LepB may ensure a stable association with the inner membrane that in turn allows the colicin recognition by FtsH. We have also shown that the outer membrane protease OmpT is responsible for alternative and distinct endoproteolytic cleavages of colicins D and E3 in vitro, presumably reflecting its known role in the bacterial defense against antimicrobial peptides. Even though the OmpT-catalyzed in vitro cleavage also liberates the catalytic domain from colicins D and E3, it is not involved in the processing of nuclease colicins during their import into the cytoplasm