Le recyclage des ARN débute par un étape de déadenylation ou la queue poly (A) est enzymatiquement clivée. La deadenylation est l’étape limitante dans le processus de dégradation des ARN. In vivo la deadenylation s’effectue successivement par les complexes multi-protéiques Pan2-Pan3 et Ccr4-Not. Le complexe Ccr4-not est conservé chez les eucaryotes et considéré comme le complexe prédominant responsable de l’activité de déadenylation dans la cellule. Le complexe est compose de neuf protéines organisées autour de la protéine d’échafaudage Not1. Le complexe comprend quatre modules distincts ; le module de déadenylation, la module Caf40, le module N-terminal et le module C-terminal. Mon mémoire de thèse regroupe les études structurales qui ont contribuées à caractériser les structures des différents modules à la fois chez la levure et chez l’humain / MRNA turnover begins with deadenylation where in the poly(A) tail at the 3’ end of the mRNA is removed. Deadenylation is the rate-limiting step of the decay pathway. In vivo, deadenylation is carried out by two major macromolecular complexes, the Pan2-Pan3 complex and the Ccr4-Not complex. The Ccr4-Not complex is a multi-protein complex that is evolutionarily conserved in all eukaryotes and is considered to be the major deadenylase complex in the cell. In S. cerevisiae, the Ccr4-Not complex is composed of nine subunits and is built around the scaffolding protein Not1. Structurally, the Ccr4-Not complex assembles into four separate modules with distinct domains of Not1 acting as a scaffold for individual modules. The four modules include the N-terminal module, the deadenylase module, the Caf40 module and the C-terminal module. With the exception of the C-terminal module, the architecture and biochemical role of all other modules of the yeast Ccr4-Not complex has been characterized. My doctoral thesis is focused on the elucidation of the architecture of the human of the yeast Ccr4-Not complex

Chez la levure fissipare S. pombe, certains gènes méiotiques sont exprimés de façon constitutive pendant la croissance végétative. Cependant, pour empêcher le déclenchement prématuré de la méiose, la cellule a mis en place un système de dégradation sélective des ARN messagers correspondant. La protéine de liaison à l’ARN Mmi1, de la famille YTH, reconnaît des répétitions de motifs spécifiques (UNAAAC) au sein des transcrits et dirige ces derniers vers la dégradation par l’exosome nucléaire. Lors de l’entrée en méiose, Mmi1 est séquestré par un complexe ribonucléoprotéique comprenant la protéine de méiose Mei2 et l’ARN noncodant meiRNA, ce qui permet aux ARNm méiotiques d’être exportés et traduits. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au rôle de Mmi1 dans la dégradation des transcrits méiotiques pendant la croissance végétative. En accord avec des études récentes, nos travaux montrent que Mmi1 interagit étroitement avec le complexe Ccr4-Not de déadenylation des ARNm. Cette interaction est fonctionnelle car Ccr4-Not est requis pour la dégradation des ARNs méiotiques. De façon surprenante, cependant, l’activité de déadénylation n’est pas requise. Nos analyses génétiques et biochimiques suggèrent que la sous-unité E3 ubiquitin ligase Mot2 de Ccr4-Not ubiquitine un pool de l’inhibiteur de Mmi1, la protéine Mei2, pour faciliter sa dégradation par le protéasome. Cette voie de régulation permet de maintenir la fonction de Mmi1 et donc la répression des ARNm méiotiques dans les cellules mitotiques. Ainsi, Mmi1 a une double fonction: cibler les ARNm méiotiques vers la dégradation par l’exosome nucléaire, et recruter Ccr4-Not pour ubiquitiner et dégrader son propre inhibiteur Mei2. Ces résultats mettent également en avant un nouveau rôle pour la sous-unité E3 ligase du complexe Ccr4-Not dans le contrôle de la différenciation sexuelle. Des expériences supplémentaires indiquent que le domaine YTH de liaison à l’ARN de Mmi1, mais pas l’ARN noncodant meiRNA, est requis pour la dégradation de Mei2. De façon importante, nos données révèlent aussi que le domaine YTH de Mmi1 a un rôle clé dans l’interaction avec Mei2. Ceci suggère fortement que le domaine YTH agit comme un module bifonctionnel, permettant la liaison non seulement aux ARNs méiotiques mais aussi aux protéines comme Mei2. Nous discutons ces résultats dans le contexte de la littérature actuelle et proposons un nouveau modèle du contrôle de la différenciation sexuelle par le système Mmi1-Mei2. / In the fission yeast S. pombe, several meiotic mRNAs are constitutively expressed during the mitotic cell cycle. In order to avoid untimely entry into meiosis, cells have adopted a degradation system that selectively eliminates the corresponding mRNAs. The YTH family RNA-binding protein Mmi1 recognizes specific sequence motifs within these transcripts (UNAAAC) and allows their targeting to the nuclear exosome for degradation. Upon entry into meiosis, Mmi1 is sequestered in a ribonucleoprotein complex, composed by the meiotic protein Mei2 and the non-coding RNA meiRNA, allowing meiotic mRNAs to be exported and translated. During my PhD studies, I focused my interest on the role of Mmi1 in the degradation of meiotic transcripts during vegetative growth. In accord with recent studies, our results show that Mmi1 stably interacts with the mRNA deadenylation complex Ccr4-Not. This interaction has a functional relevance since Ccr4-Not is involved in the degradation of meiotic mRNAs. Surprisingly, however, the deadenylation activity is not required. Our genetic and biochemical analyses indicate that the E3 ubiquitin ligase Mot2, subunit of the Ccr4-Not complex, ubiquitinate a pool of the inhibitor of Mmi1, the Mei2 protein, to favor its degradation by the proteasome. This regulatory mechanism ensures the maintenance of Mmi1 in a functional state, leading to the persistent repression of meiotic mRNAs in mitotic cells. Thus, Mmi1 has a dual role: in nuclear mRNA surveillance, by targeting meiotic transcripts for degradation by the exosome, and in protein degradation, by recruiting Ccr4-Not to its own inhibitor Mei2. These results have also revealed a novel role for the ubiquitin ligase activity of the Ccr4-Not subunit Mot2 in the control of sexual differentiation in fission yeast. Our supplemental results indicate that the YTH RNA-binding domain of Mmi1, but not the non-coding RNA meiRNA, is required for the degradation of Mei2. Remarkably, our results also revealed that the YTH domain of Mmi1 has a key role in the interaction with Mei2. This strongly suggests that the YTH domain acts as a bifunctional module, allowing the binding not only to meiotic RNAs but also to proteins, such as Mei2. We discuss these results within the context of the current literature and we propose a novel model for the control of sexual differentiation by the Mmi1-Mei2 system.