Les circuits et réseaux d’eau subissent épisodiquement des problèmes de contamination par des microorganismes tels que Legionella pneumophila, conduisant à la dégradation de la qualité microbiologique de l’eau circulante. De nouveaux moyens de traitements doivent être mis en place de façon notamment à limiter l’usage de biocides chimiques. Ce travail de thèse s’inscrit dans cette problématique et a pour objectif d’identifier de nouveaux composés actifs contre L. pneumophila en tenant compte de son comportement et de ses interactions au sein de son microenvironnement. De manière à obtenir des composés produits par des souches bactériennes appartenant à la même niche écologique que L. pneumophila, une campagne de prélèvement d’eau a été réalisée. Un total de 273 isolats environnementaux ont été isolés et testés contre L. pneumophila. Les résultats obtenus indiquent que 178 de ces isolats (65%) présentent une activité anti-Legionella. Quatre souches ont ensuite été sélectionnées (Aeromonas bestiarum SW257, Rahnella aquatilis SW265, Flavobacterium spp. PW52 et Pseudomonas spp PW329) et les composés actifs produits ont été caractérisés. A. bestiarum SW257 produit un peptide anti-Legionella. Flavobacterium sp. PW52 produit un mélange de composés anti-Legionella ayant des propriétés tensioactives, les flavolipides. Pseudomonas sp. PW329 produit des composés organiques volatiles, identifiés par SPME-GC-MS, actifs contre L. pneumophila. Enfin, R. aquatilis SW265 produit un sidérophore à activité anti-Legionella. / Water is essential to sustain life and water sources used for human consumption must be biologically safe, to avoid any risk for health. Indeed, the most common and widespread health risk associated with drinking water are infectious diseases caused by pathogenic microorganisms such as Legionella pneumophila. However, more efforts are needed to control disinfection by-products and minimize people exposure to potentially hazardous chemicals while maintaining adequate disinfection to ensure good water quality. Thus, this work aimed to find natural antibacterial compounds to control L. pneumophila growth using bacteria from freshwater environments. Environmental aquatic bacteria were sampled from five freshwater sources to get a large culturable bacterial collection. A total of 273 bacterial isolates were recovered and screened for their ability to produce anti-Legionella compounds. Among those, 178 (65%) were shown to be active against L. pneumophila. Four strains (Aeromonas bestiarum SW257, Rahnella aquatilis SW265, Flavobacterium spp. PW52, and Pseudomonas spp PW329) were next selected for the characterization of their active compounds. A. bestiarum SW257 produces an anti-Legionella peptide, and Flavobacterium spp PW52 produces a mixture of anti-Legionella compounds with surface active properties, named flavolipids. Finally Pseudomonas sp. PW329 delivers many volatile organic compounds, and R. aquatilis SW26 produces a anti-Legionella siderophore.

Les fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) sont des enzymes glycolytiques (EC 4.1.2.13) qui catalysent la transformation réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en deux trioses-phosphates, le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP). Il existe deux classes de FBPA qui diffèrent au niveau de leur mécanisme catalytique. Les classes I passent par la formation d’un intermédiaire covalent de type iminium alors que les classes II, métallodépendantes, utilisent généralement un zinc catalytique. Contrairement au mécanisme des classes I qui a été très étudié, de nombreuses interrogations subsistent au sujet de celui des classes II. Nous avons donc entrepris une analyse détaillée de leur mécanisme réactionnel en nous basant principalement sur la résolution de structures cristallographiques. De nombreux complexes à haute résolution furent obtenus et ont permis de détailler le rôle de plusieurs résidus du site actif de l’enzyme. Nous avons ainsi corrigé l’identification du résidu responsable de l’abstraction du proton de l’O4 du FBP, une étape cruciale du mécanisme. Ce rôle, faussement attribué à l’Asp82 (chez Helicobacter pylori), est en fait rempli par l’His180, un des résidus coordonant le zinc. L’Asp82 n’en demeure pas moins essentiel car il oriente, active et stabilise les substrats. Enfin, notre étude met en évidence le caractère dynamique de notre enzyme dont la catalyse nécessite la relocalisation du zinc et de nombreux résidus. La dynamique de la protéine ne permet pas d’étudier tous les aspects du mécanisme uniquement par l’approche cristallographique. En particulier, le résidu effectuant le transfert stéréospécifique du proton pro(S) sur le carbone 3 (C3) du DHAP est situé sur une boucle qui n’est visible dans aucune de nos structures. Nous avons donc développé un protocole de dynamique moléculaire afin d’étudier sa dynamique. Validé par l’étude d’inhibiteurs de la classe I, l’application de notre protocole aux FBPA de classe II a confirmé l’identification du résidu responsable de cette abstraction chez Escherichia coli (Glu182) mais pointe vers un résidu diffèrent chez H. pylori (Glu149 au lieu de Glu142). Nos validations expérimentales confirment ces observations et seront consolidées dans le futur. Les FBPA de classe II sont absentes du protéome humain mais sont retrouvées chez de nombreux pathogènes, pouvant même s'y révéler essentielles. Elles apparaissent donc comme étant une cible idéale pour le développement de nouveaux agents anti-microbiens. L’obtention de nouveaux analogues des substrats pour ces enzymes a donc un double intérêt, obtenir de nouveaux outils d’étude du mécanisme mais aussi développer des molécules à visée pharmacologique. En collaboration avec un groupe de chimistes, nous avons optimisé le seul inhibiteur connu des FBPA de classe II. Les composés obtenus, à la fois plus spécifiques et plus puissants, permettent d’envisager une utilisation pharmacologique. En somme, c’est par l’utilisation de techniques complémentaires que de nouveaux détails moléculaires de la catalyse des FBPA de classe II ont pu être étudiés. Ces techniques permettront d’approfondir la compréhension fine du mécanisme catalytique de l’enzyme et offrent aussi de nouvelles perspectives thérapeutiques. / Fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) are glycolytic enzymes (EC 4.1.2.13) that catalyze the reversible cleavage of fructose-1,6-bisphosphate (FBP) into the triose phosphates, glyceraldehyde-3-phosphate (G3P) and dihydroxyacetone phosphate (DHAP). There are two classes of FBPAs that differ at the level of their mechanism. Class I FBPAs form a covalent iminium intermediate whereas class II FBPAs, being metalloenzymes, generally use a catalytic zinc in their reaction mechanism. In contrast to the mechanism of the class I FBPAs, which has been thoroughly studied, there are several unresolved inquiries as to the mechanism of class II FBPAs. We have therefore pursued a detailed analysis of the reaction mechanism using as a primary tool the elucidation of crystallographic structures. Several high resolution complexes have been resolved and have provided critical evidence to help us suggest the implication and role of several key residues in the active site. Consequently, we have correctly identified the residue which is responsible for the abstraction of the O4 proton from FBP, a vital step in the reaction mechanism. The residue responsible for this abstraction, which had incorrectly been assigned to Asp82 (in Helicobacter pylori), has been appropriately consigned to His180, a residue which is involved in coordinating the zinc molecule. Nevertheless, Asp82 remains an important residue as it orients, activates and stabilizes substrates. Finally, our study brings to evidence the dynamic character of our enzyme in which catalysis entails the relocalization of the catalytic zinc and several residues. The complexity of this reaction, notably one of the proton exchanges in the mechanism, could not be resolved solely by crystallographic means. In fact, the residue responsible for the stereospecific transfer of the pro(S) proton on carbon 3 (C3) of DHAP is situated on a loop that was not resolved in any of our structures. We therefore developed a molecular dynamics approach to study this intricate movement. After preliminary validation by inhibitor studies with class I FBPAs, the protocol was applied to class II FBPAs and several remarkable observations emerged: the residue responsible for this abstraction in Escherichia coli is Glu182 whereas a different residue, Glu149 (instead of Glu142) appears to assume this role in H. pylori. Our preliminary validations have confirmed this observation and shall be further consolidated in the future. Class II FBP aldolases, although absent from the human proteome, are prevalently found in several pathogens, and have further been found to be essential to a number of these organisms. As such, they are ideal targets for the development of novel anti-microbial agents. Developing new analogues of the cognate substrates of these enzymes is therefore not only advantageous for mechanistic studies, but has endless pharmacological potential. In the context of a collaborative effort involving a group of chemists, a compound that initially had an inhibition constant in the millimolar range was optimized and produced a series of compounds that inhibit in the nanomolar range.

Les fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) sont des enzymes glycolytiques (EC 4.1.2.13) qui catalysent la transformation réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en deux trioses-phosphates, le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP). Il existe deux classes de FBPA qui diffèrent au niveau de leur mécanisme catalytique. Les classes I passent par la formation d’un intermédiaire covalent de type iminium alors que les classes II, métallodépendantes, utilisent généralement un zinc catalytique. Contrairement au mécanisme des classes I qui a été très étudié, de nombreuses interrogations subsistent au sujet de celui des classes II. Nous avons donc entrepris une analyse détaillée de leur mécanisme réactionnel en nous basant principalement sur la résolution de structures cristallographiques. De nombreux complexes à haute résolution furent obtenus et ont permis de détailler le rôle de plusieurs résidus du site actif de l’enzyme. Nous avons ainsi corrigé l’identification du résidu responsable de l’abstraction du proton de l’O4 du FBP, une étape cruciale du mécanisme. Ce rôle, faussement attribué à l’Asp82 (chez Helicobacter pylori), est en fait rempli par l’His180, un des résidus coordonant le zinc. L’Asp82 n’en demeure pas moins essentiel car il oriente, active et stabilise les substrats. Enfin, notre étude met en évidence le caractère dynamique de notre enzyme dont la catalyse nécessite la relocalisation du zinc et de nombreux résidus. La dynamique de la protéine ne permet pas d’étudier tous les aspects du mécanisme uniquement par l’approche cristallographique. En particulier, le résidu effectuant le transfert stéréospécifique du proton pro(S) sur le carbone 3 (C3) du DHAP est situé sur une boucle qui n’est visible dans aucune de nos structures. Nous avons donc développé un protocole de dynamique moléculaire afin d’étudier sa dynamique. Validé par l’étude d’inhibiteurs de la classe I, l’application de notre protocole aux FBPA de classe II a confirmé l’identification du résidu responsable de cette abstraction chez Escherichia coli (Glu182) mais pointe vers un résidu diffèrent chez H. pylori (Glu149 au lieu de Glu142). Nos validations expérimentales confirment ces observations et seront consolidées dans le futur. Les FBPA de classe II sont absentes du protéome humain mais sont retrouvées chez de nombreux pathogènes, pouvant même s'y révéler essentielles. Elles apparaissent donc comme étant une cible idéale pour le développement de nouveaux agents anti-microbiens. L’obtention de nouveaux analogues des substrats pour ces enzymes a donc un double intérêt, obtenir de nouveaux outils d’étude du mécanisme mais aussi développer des molécules à visée pharmacologique. En collaboration avec un groupe de chimistes, nous avons optimisé le seul inhibiteur connu des FBPA de classe II. Les composés obtenus, à la fois plus spécifiques et plus puissants, permettent d’envisager une utilisation pharmacologique. En somme, c’est par l’utilisation de techniques complémentaires que de nouveaux détails moléculaires de la catalyse des FBPA de classe II ont pu être étudiés. Ces techniques permettront d’approfondir la compréhension fine du mécanisme catalytique de l’enzyme et offrent aussi de nouvelles perspectives thérapeutiques. / Fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) are glycolytic enzymes (EC 4.1.2.13) that catalyze the reversible cleavage of fructose-1,6-bisphosphate (FBP) into the triose phosphates, glyceraldehyde-3-phosphate (G3P) and dihydroxyacetone phosphate (DHAP). There are two classes of FBPAs that differ at the level of their mechanism. Class I FBPAs form a covalent iminium intermediate whereas class II FBPAs, being metalloenzymes, generally use a catalytic zinc in their reaction mechanism. In contrast to the mechanism of the class I FBPAs, which has been thoroughly studied, there are several unresolved inquiries as to the mechanism of class II FBPAs. We have therefore pursued a detailed analysis of the reaction mechanism using as a primary tool the elucidation of crystallographic structures. Several high resolution complexes have been resolved and have provided critical evidence to help us suggest the implication and role of several key residues in the active site. Consequently, we have correctly identified the residue which is responsible for the abstraction of the O4 proton from FBP, a vital step in the reaction mechanism. The residue responsible for this abstraction, which had incorrectly been assigned to Asp82 (in Helicobacter pylori), has been appropriately consigned to His180, a residue which is involved in coordinating the zinc molecule. Nevertheless, Asp82 remains an important residue as it orients, activates and stabilizes substrates. Finally, our study brings to evidence the dynamic character of our enzyme in which catalysis entails the relocalization of the catalytic zinc and several residues. The complexity of this reaction, notably one of the proton exchanges in the mechanism, could not be resolved solely by crystallographic means. In fact, the residue responsible for the stereospecific transfer of the pro(S) proton on carbon 3 (C3) of DHAP is situated on a loop that was not resolved in any of our structures. We therefore developed a molecular dynamics approach to study this intricate movement. After preliminary validation by inhibitor studies with class I FBPAs, the protocol was applied to class II FBPAs and several remarkable observations emerged: the residue responsible for this abstraction in Escherichia coli is Glu182 whereas a different residue, Glu149 (instead of Glu142) appears to assume this role in H. pylori. Our preliminary validations have confirmed this observation and shall be further consolidated in the future. Class II FBP aldolases, although absent from the human proteome, are prevalently found in several pathogens, and have further been found to be essential to a number of these organisms. As such, they are ideal targets for the development of novel anti-microbial agents. Developing new analogues of the cognate substrates of these enzymes is therefore not only advantageous for mechanistic studies, but has endless pharmacological potential. In the context of a collaborative effort involving a group of chemists, a compound that initially had an inhibition constant in the millimolar range was optimized and produced a series of compounds that inhibit in the nanomolar range.