Saccharomyces cerevisiae tem sido empregada como modelo experimental em testes de mutagenicidade, devido à presença de um sistema citocromo P-450 capaz de metabolizar substâncias promutagênicas a sua forma ativa. O grande número de linhagens e as diferenças na capacidade de produção de citocromo P-450 dificultam a definição das condições ideais de cultivo para obtenção de células com alto conteúdo desta enzima, sendo que poucos são os trabalhos publicados a este respeito. O objetivo deste trabalho é avaliar as melhores condições de cultivo para produção de citocromo P-450 em S. cerevisiae. Para tanto, quatro diferentes linhagens foram cultivadas sob diferentes condições, a fim de avaliar a influência de fatores como fonte de carbono, tempo de incubação e adição de etanol ao meio de cultura. Foi verificado que células cultivadas na presença de fontes de carbono altamente fermentáveis e coletadas no final da fase de crescimento exponencial apresentavam o maior conteúdo da enzima. Observou-se também que o nível de citocromo P-450 variou entre as linhagens estudadas, bem como o tempo de incubação para atingir a concentração máxima, sendo que o conteúdo mais alto foi encontrado na linhagem ATCC 44953. A adição de 2 % de etanol (v/v) ao meio de cultura contendo 2 % de glicose (p/v) resultou em aumento do nível de citocromo P-450, indicando o efeito indutor do etanol. Os resultados deste trabalho mostram a importância de estabelecer condições de cultivo para obtenção de células com altas concentrações da enzima, uma vez que fatores como a composição do meio de cultura, o tempo de incubação e a linhagem empregada podem influenciar a produção de citocromo P-450 por S. cerevisiae. / Saccharomyces cerevisiae has been employed as experimental model in mutagenicity tests due to the presence of a cytochrome P-450 system capable of metabolizing promutagens to its active form. The large number of S.cerevisiae strains and their different capacity of producing cytochrome P-450 make the definition of the ideal cultivation conditions to obtain cells with high enzyme content difficult. Moreover, there are only a few reports related to this subject. The aim of this work is evaluate the ideal cultivation conditions to produce cytochrome P-450 by S. cerevisiae. For this purpose, four different S. cerevisiae strains were cultured under different cultivation conditions in order to evaluate the influence of factors such as carbon source, incubation time and addition of ethanol to the culture media. It was found that the cytochrome P-450 content was higher in cells growth on strongly fermentable carbon source and harvested at the end of the exponential growth phase. Our results also showed that the cytochrome P-450 concentration varied among the strains studied, as well as the incubation time to reach the maximum level. The highest content was found in the ATCC 44953 strain and the addition of 2 % ethanol (w/w) to the culture media containing 2 % glucose (w/v) increased the cytochrome P-450 amount, indicating the induction of cytochrome P-450 production by ethanol action. These results show the importance of establishment of the cultivation conditions to obtain cells with high cytochrome P-450 concentrations, considering that factors such as the culture media, incubation time and strain employed can influence the cytochrome P-450 production by S.cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae tem sido empregada como modelo experimental em testes de mutagenicidade, devido à presença de um sistema citocromo P-450 capaz de metabolizar substâncias promutagênicas a sua forma ativa. O grande número de linhagens e as diferenças na capacidade de produção de citocromo P-450 dificultam a definição das condições ideais de cultivo para obtenção de células com alto conteúdo desta enzima, sendo que poucos são os trabalhos publicados a este respeito. O objetivo deste trabalho é avaliar as melhores condições de cultivo para produção de citocromo P-450 em S. cerevisiae. Para tanto, quatro diferentes linhagens foram cultivadas sob diferentes condições, a fim de avaliar a influência de fatores como fonte de carbono, tempo de incubação e adição de etanol ao meio de cultura. Foi verificado que células cultivadas na presença de fontes de carbono altamente fermentáveis e coletadas no final da fase de crescimento exponencial apresentavam o maior conteúdo da enzima. Observou-se também que o nível de citocromo P-450 variou entre as linhagens estudadas, bem como o tempo de incubação para atingir a concentração máxima, sendo que o conteúdo mais alto foi encontrado na linhagem ATCC 44953. A adição de 2 % de etanol (v/v) ao meio de cultura contendo 2 % de glicose (p/v) resultou em aumento do nível de citocromo P-450, indicando o efeito indutor do etanol. Os resultados deste trabalho mostram a importância de estabelecer condições de cultivo para obtenção de células com altas concentrações da enzima, uma vez que fatores como a composição do meio de cultura, o tempo de incubação e a linhagem empregada podem influenciar a produção de citocromo P-450 por S. cerevisiae. / Saccharomyces cerevisiae has been employed as experimental model in mutagenicity tests due to the presence of a cytochrome P-450 system capable of metabolizing promutagens to its active form. The large number of S.cerevisiae strains and their different capacity of producing cytochrome P-450 make the definition of the ideal cultivation conditions to obtain cells with high enzyme content difficult. Moreover, there are only a few reports related to this subject. The aim of this work is evaluate the ideal cultivation conditions to produce cytochrome P-450 by S. cerevisiae. For this purpose, four different S. cerevisiae strains were cultured under different cultivation conditions in order to evaluate the influence of factors such as carbon source, incubation time and addition of ethanol to the culture media. It was found that the cytochrome P-450 content was higher in cells growth on strongly fermentable carbon source and harvested at the end of the exponential growth phase. Our results also showed that the cytochrome P-450 concentration varied among the strains studied, as well as the incubation time to reach the maximum level. The highest content was found in the ATCC 44953 strain and the addition of 2 % ethanol (w/w) to the culture media containing 2 % glucose (w/v) increased the cytochrome P-450 amount, indicating the induction of cytochrome P-450 production by ethanol action. These results show the importance of establishment of the cultivation conditions to obtain cells with high cytochrome P-450 concentrations, considering that factors such as the culture media, incubation time and strain employed can influence the cytochrome P-450 production by S.cerevisiae.

Eucalyptus benthamii tem se mostrado especialmente vantajoso como alternativa ao cultivo em regiões frias, justificando esforços para o estabelecimento de protocolos para sua micropropagação. Porém, as matrizes são preferencialmente selecionadas quando adultas (material apresenta menor competência morfogênica), tornando a micropropagação dependente de maior número de subcultivos e maior tempo para se reverter o material ao rejuvenescimento. Assim, a redução das perdas in vitro tem merecido atenção, como por exemplo, as manifestações endofíticas, que exigem maximização da eficiência da cultura e adequações no protocolo, visando minimizá-las, possibilitando melhorar o entendimento das relações estabelecidas e mantidas entre os endófitos e seu hospedeiro durante a micropropagação. Dessa maneira, foram utilizadas minicepas provenientes de duas fontes de miniestacas coletadas a partir do brotamento de gemas epicórmicas de megaestacas da base da copa e de brotamentos do anelamento da base do tronco, de uma matriz de E. benthamii com 13 anos de idade, estabelecidas em minijardim clonal sob condição de casa de vegetação, com o objetivo de avaliar como se dá a multiplicação, sob diferentes condições de cultivo, das duas fontes de explantes (minicepas); analisar se a frequência e intensidade das manifestações endofíticas são afetadas pelas diferentes condições de cultivo; investigar a ocorrência de alterações na comunidade bacteriana endofítica devido à alteração das condições de cultivo e fase da micropropagação (in vivo = minicepas, e in vitro = microcepas, material alongado e enraizado). Visando atender estes objetivos, a pesquisa se dividiu em duas partes. Na primeira (capitulo 3) o desenvolvimento, os aspectos morfofisiológicos, histoquímicos e a manifestação endofítica foram avaliados na multiplicação das duas fontes de explante sob diferentes meios e condições de cultivo. Na segunda (capítulo 4) as comunidades bacterianas endofíticas foram analisadas por meio de PCR-DGGE, baseada na região V6 do gene 16S DNAr. Os resultados mostraram que as microcepas provenientes de megaestaca tiveram melhor desenvolvimento independentemente do tratamento e maior frequência de manifestações endofíticas, comparando-se com as de anelamento. As comunidades bacterinas endofíticas foram distintas entre as amostras in vivo e in vitro, e se alteraram ao longo dos subcultivos e nas amostras alongadas e enraizadas. As diferenças existentes no desenvolvimento das microcepas podem ser inerentes à totipotencialidade do material, mas também podem ser afetadas, tanto pela ocorrência de manifestação, quanto pela comunidade bacteriana endofítica mais ou menos sensível ao processo de micropropagação, auxiliando ou prejudicando o desenvolvimento in vitro de seus hospedeiros. Cabe destacar, ainda, que mesmo em um sistema asséptico e ambientalmente controlado, os microrganismos endofíticos que resistiram a todo processo de desinfestação e cultivo, não estão \"adormecidos\", muito pelo contrário podem se alterar em quantidade à medida que seu hospedeiro é submetido a um novo sistema de cultivo (introdução) ou uma nova fase dentro da micropropagação (multiplicação → alongamento e enraizamnento) ou, ainda, ao longo dos subcultivos. Sendo assim, a complexa rede de relações das plantas com seus endófitos não cessa durante o cultivo in vitro, ao contrário mantém-se dinâmica. / Eucalyptus benthamii has proven to be especially advantageous as an alternative culture in cold regions, justifying efforts to establish protocols for micropropagation. However, the matrices are preferably selected when adults (material with lower morphogenic efficiency), making micropropagation more dependent of subcultures and too longer to reverse the material to rejuvenation. Thus, reduction of losses in vitro has deserved attention, such for example the endophytic manifestations that require the maximization of efficiency culture and adjustments to the Protocol, in order to minimize them, enabling better understanding of the relations established and maintained between endophytes and its host along micropropagation. For this, mini-stumps were used from two sources of mini-cuttings collected from the epicormic shoots of mega-cuttings from the treetop base and shoots from girdling from the trunk base, both of one E. benthamii matrix with 13 years of age established in clonal mini garden under greenhouse condition, aimed to evaluate how is the multiplication of two sources of explants (mini-stumps) under different growing conditions; analyze how the endophytic manifestations frequency and intensity are affected by different conditions; investigate the changes to occurrence in the endophytic bacterial community due to the variation of culture conditions and micropropagation phase (in vivo = mini-stumps, and in vitro = micro-stumps, elongated and rooted materials). In order to meet these objectives, the research was divided in two parts. In the first (chapter 3) the development, morphophysiological aspects, histochemical and endophytic manifestation were evaluated in the multiplication of the two explants sources from different media and culture conditions. In the second (chapter 4) endophytic bacterial communities were analyzed by PCR-DGGE based on the V6 region of 16S rDNA gene. The results showed that micro-stumps from mega-cuttings had better development regardless of treatment and increased frequency of endophytic events, comparing with the girdling. Endophytic bacterial communities were different between samples in vivo and in vitro, and have changed over the subcultures and the elongated and rooted samples. The differences in the development of micro-stumps can be explained by the totipotentiality inherent to the material, but may also be affected by both the manifestation occurrence and the endophytic bacterial community more or less sensitive to the micropropagation, helping or harming the in vitro development of their hosts. We also highlight that even in an aseptic and environmentally controlled system, the endophytic microorganisms that resisted the whole process of disinfection and cultivation, are not \"asleep\", quite the opposite may change in quantity when your host is subjected to a new cultivation system (in vitro establishment) and a new phase within the micropropagation (multiplication → stretching and enraizamnento), or even along the subcultures. This way, the complex network of relationships of the plant with their endophyte does not cease during the in vitro culture, unlike remains dynamic.

Eucalyptus benthamii tem se mostrado especialmente vantajoso como alternativa ao cultivo em regiões frias, justificando esforços para o estabelecimento de protocolos para sua micropropagação. Porém, as matrizes são preferencialmente selecionadas quando adultas (material apresenta menor competência morfogênica), tornando a micropropagação dependente de maior número de subcultivos e maior tempo para se reverter o material ao rejuvenescimento. Assim, a redução das perdas in vitro tem merecido atenção, como por exemplo, as manifestações endofíticas, que exigem maximização da eficiência da cultura e adequações no protocolo, visando minimizá-las, possibilitando melhorar o entendimento das relações estabelecidas e mantidas entre os endófitos e seu hospedeiro durante a micropropagação. Dessa maneira, foram utilizadas minicepas provenientes de duas fontes de miniestacas coletadas a partir do brotamento de gemas epicórmicas de megaestacas da base da copa e de brotamentos do anelamento da base do tronco, de uma matriz de E. benthamii com 13 anos de idade, estabelecidas em minijardim clonal sob condição de casa de vegetação, com o objetivo de avaliar como se dá a multiplicação, sob diferentes condições de cultivo, das duas fontes de explantes (minicepas); analisar se a frequência e intensidade das manifestações endofíticas são afetadas pelas diferentes condições de cultivo; investigar a ocorrência de alterações na comunidade bacteriana endofítica devido à alteração das condições de cultivo e fase da micropropagação (in vivo = minicepas, e in vitro = microcepas, material alongado e enraizado). Visando atender estes objetivos, a pesquisa se dividiu em duas partes. Na primeira (capitulo 3) o desenvolvimento, os aspectos morfofisiológicos, histoquímicos e a manifestação endofítica foram avaliados na multiplicação das duas fontes de explante sob diferentes meios e condições de cultivo. Na segunda (capítulo 4) as comunidades bacterianas endofíticas foram analisadas por meio de PCR-DGGE, baseada na região V6 do gene 16S DNAr. Os resultados mostraram que as microcepas provenientes de megaestaca tiveram melhor desenvolvimento independentemente do tratamento e maior frequência de manifestações endofíticas, comparando-se com as de anelamento. As comunidades bacterinas endofíticas foram distintas entre as amostras in vivo e in vitro, e se alteraram ao longo dos subcultivos e nas amostras alongadas e enraizadas. As diferenças existentes no desenvolvimento das microcepas podem ser inerentes à totipotencialidade do material, mas também podem ser afetadas, tanto pela ocorrência de manifestação, quanto pela comunidade bacteriana endofítica mais ou menos sensível ao processo de micropropagação, auxiliando ou prejudicando o desenvolvimento in vitro de seus hospedeiros. Cabe destacar, ainda, que mesmo em um sistema asséptico e ambientalmente controlado, os microrganismos endofíticos que resistiram a todo processo de desinfestação e cultivo, não estão \"adormecidos\", muito pelo contrário podem se alterar em quantidade à medida que seu hospedeiro é submetido a um novo sistema de cultivo (introdução) ou uma nova fase dentro da micropropagação (multiplicação → alongamento e enraizamnento) ou, ainda, ao longo dos subcultivos. Sendo assim, a complexa rede de relações das plantas com seus endófitos não cessa durante o cultivo in vitro, ao contrário mantém-se dinâmica. / Eucalyptus benthamii has proven to be especially advantageous as an alternative culture in cold regions, justifying efforts to establish protocols for micropropagation. However, the matrices are preferably selected when adults (material with lower morphogenic efficiency), making micropropagation more dependent of subcultures and too longer to reverse the material to rejuvenation. Thus, reduction of losses in vitro has deserved attention, such for example the endophytic manifestations that require the maximization of efficiency culture and adjustments to the Protocol, in order to minimize them, enabling better understanding of the relations established and maintained between endophytes and its host along micropropagation. For this, mini-stumps were used from two sources of mini-cuttings collected from the epicormic shoots of mega-cuttings from the treetop base and shoots from girdling from the trunk base, both of one E. benthamii matrix with 13 years of age established in clonal mini garden under greenhouse condition, aimed to evaluate how is the multiplication of two sources of explants (mini-stumps) under different growing conditions; analyze how the endophytic manifestations frequency and intensity are affected by different conditions; investigate the changes to occurrence in the endophytic bacterial community due to the variation of culture conditions and micropropagation phase (in vivo = mini-stumps, and in vitro = micro-stumps, elongated and rooted materials). In order to meet these objectives, the research was divided in two parts. In the first (chapter 3) the development, morphophysiological aspects, histochemical and endophytic manifestation were evaluated in the multiplication of the two explants sources from different media and culture conditions. In the second (chapter 4) endophytic bacterial communities were analyzed by PCR-DGGE based on the V6 region of 16S rDNA gene. The results showed that micro-stumps from mega-cuttings had better development regardless of treatment and increased frequency of endophytic events, comparing with the girdling. Endophytic bacterial communities were different between samples in vivo and in vitro, and have changed over the subcultures and the elongated and rooted samples. The differences in the development of micro-stumps can be explained by the totipotentiality inherent to the material, but may also be affected by both the manifestation occurrence and the endophytic bacterial community more or less sensitive to the micropropagation, helping or harming the in vitro development of their hosts. We also highlight that even in an aseptic and environmentally controlled system, the endophytic microorganisms that resisted the whole process of disinfection and cultivation, are not \"asleep\", quite the opposite may change in quantity when your host is subjected to a new cultivation system (in vitro establishment) and a new phase within the micropropagation (multiplication → stretching and enraizamnento), or even along the subcultures. This way, the complex network of relationships of the plant with their endophyte does not cease during the in vitro culture, unlike remains dynamic.