Dentre as poucas espécies de Eucalyptus que apresentam aptidão ao cultivo em regiões de baixas temperaturas e a geadas frequentes, destacam-se genótipos de Eucalyptus benthamii que representam opções para futuros plantios florestais em diferentes regiões brasileiras. Porém, existem poucas informações quanto a obtenção de mudas clonais, e se focarmos as espécies aconselhadas para o plantio em condições subtropicais, tal carência é ainda maior, principalmente ao considerar os fatores endógenos e exógenos para o enraizamento adventício. Baseado no exposto, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar aspectos morfofisiológicos da clonagem de genótipos de Eucalyptus benthamii por meio das técnicas de miniestaquia e micropropagação. Para tanto, o trabalho foi dividido em quatro estudos básicos. O primeiro estudo (Capítulo 2) baseou-se na avaliação da morfofisiologia de um minijardim clonal em relação a diferentes concentrações de Zn e B ao longo de sucessivas coletas de brotações. O segundo estudo (Capítulo 3) foi baseado em avaliar o enraizamento de miniestacas quanto a diferentes concentrações de Zn e B e aplicação de AIB ao longo de sucessivas coletas de brotações. O terceiro estudo (Capítulo 4) baseou-se em avaliar a dinâmica de enraizamento de miniestacas quanto a diferentes concentrações de AIB, tempo ótimo de permanência de miniestacas enraizadas em casa de vegetação e a origem da conexão vascular da raiz emitida. Por fim, o quarto estudo (Capítulo 5) foi baseado no desenvolvimento e estabelecimento de protocolo para a micropropagação visando a produção de microcepas para formar um microjardim clonal. Em termos gerais, a sobrevivência das minicepas, produção de miniestacas por metro quadrado ao ano e os teores foliares de macro e micronutrientes variaram significativamente em relação as concentrações de Zn e B, apresentando diferentes respostas ao longo das coletas de brotações no minijardim clonal. Os teores foliares de carboidratos solúveis não estruturais variaram significativamente de acordo com as coletas de brotações e solução nutritiva, sendo que o aumento das concentrações de Zn e B na solução nutritiva induziu a redução dos teores de carboidratos solúveis não estruturais. A porcentagem de enraizamento dos materiais clonais foi baixa, sendo considerados de difícil propagação pela miniestaquia. A presença de Zn e B na solução nutritiva (concentrações variando de 1,0 a 2,0 mg L-1) associadas a presença de AIB induziram os maiores índices de enraizamento. A aplicação de AIB na concentração de 2.000 mg L-1 favoreceu a indução de raízes, e o intervalo de 35 a 42 dias foi o mais indicado para a permanência das miniestacas enraizadas em casa de vegetação. De acordo com as análises histológicas da rizogênese foi verificado que a raiz adventícia apresentou conexão direta com o câmbio vascular. A multiplicação in vitro de gemas axilares dependeu do clone, meio de cultura e concentração de regulador de crescimento e, o alongamento de brotações dependeu do clone e regulador de crescimento. O protocolo de micropropagação foi eficiente para a produção de microplantas de Eucalyptus benthamii as quais podem ser usadas para a formação de um microjardim clonal. / Few Eucalyptus species present adaptation for cultivation in regions subject to low temperatures and frequent frosts, and Eucalyptus benthamii genotypes may represent options for future forest plantations in different regions of Brazil, in view of its excellent silvicultural performance in these conditions. However, there is little information on obtaining clones, and considering the species recommended for planting in subtropical conditions, this lack of information is even greater, mainly when considering the endogenous and exogenous factors for the adventitious rooting. Based on these information, the present work was aimed the conducting of studies on morphophysiological aspects during the cloning of Eucalyptus benthamii through of the mini-cuttings and micropropagation techniques. Therefore, the work was divided into four basic studies. The first study (Chapter 2) was based in evaluate the morphophysiology of a clonal mini-garden regarding to Zn and B concentrations during successive shoot collections. The second study (Chapter 3) was based in evaluate the induction of adventitious rooting in mini-cuttings regarding to genotype, Zn and B concentrations, shoot collections and IBA application. The third study (Chapter 4) was based in evaluate the adventitious rooting percentage of selected genotypes regarding the IBA concentration, optimal time of permanence of rooted mini-cuttings in a greenhouse and the origin of the vascular connection. Finally, the fourth study (Chapter 5) was based in develop a method for cloning of selected genotypes through micropropagation technique for the formation of a clonal micro-garden. In overall terms, mini-stumps survival, mini-cuttings production per square meter per year and foliar content of macro and micronutrients varied significantly in relation to treatments, presenting different responses according to shoots collection of the clonal mini-garden. The content of soluble carbohydrates non-structural of leaves varied regarding the shoots collection and nutrient solution. The increasing of the Zn and B concentrations in the nutrient solution induced reduction of the total content of soluble carbohydrates non-structural of leaves. The adventitious rooting percentage was low, and the genotypes were considered difficult to propagation by mini-cuttings technique. The ministumps fertigated with nutrient solutions containing Zn and B (concentrations of 1.0 at 2.0 mg L-1) associated with the IBA application presented the greater adventitious rooting percentage. The IBA application in the concentration of 2,000 mg L-1 resulted in the greater speed of rooting and rooting percentage, and the interval of 35 to 42 days was the most suitable for the permanence of mini-cuttings rooted in a greenhouse. According to the histological analysis of rhizogenesis was verified that the adventitious root presented direct connection to the vascular cambium. The in vitro multiplication of axillary buds depends of the genetic material, culture medium and concentration of plant growth regulator and, the shoots elongation depends of the genetic material and plant growth regulator. The micropropagation protocol was efficient for the microplants production of Eucalyptus benthamii and can be used to form a clonal microgarden.

Eucalyptus benthamii tem se mostrado especialmente vantajoso como alternativa ao cultivo em regiões frias, justificando esforços para o estabelecimento de protocolos para sua micropropagação. Porém, as matrizes são preferencialmente selecionadas quando adultas (material apresenta menor competência morfogênica), tornando a micropropagação dependente de maior número de subcultivos e maior tempo para se reverter o material ao rejuvenescimento. Assim, a redução das perdas in vitro tem merecido atenção, como por exemplo, as manifestações endofíticas, que exigem maximização da eficiência da cultura e adequações no protocolo, visando minimizá-las, possibilitando melhorar o entendimento das relações estabelecidas e mantidas entre os endófitos e seu hospedeiro durante a micropropagação. Dessa maneira, foram utilizadas minicepas provenientes de duas fontes de miniestacas coletadas a partir do brotamento de gemas epicórmicas de megaestacas da base da copa e de brotamentos do anelamento da base do tronco, de uma matriz de E. benthamii com 13 anos de idade, estabelecidas em minijardim clonal sob condição de casa de vegetação, com o objetivo de avaliar como se dá a multiplicação, sob diferentes condições de cultivo, das duas fontes de explantes (minicepas); analisar se a frequência e intensidade das manifestações endofíticas são afetadas pelas diferentes condições de cultivo; investigar a ocorrência de alterações na comunidade bacteriana endofítica devido à alteração das condições de cultivo e fase da micropropagação (in vivo = minicepas, e in vitro = microcepas, material alongado e enraizado). Visando atender estes objetivos, a pesquisa se dividiu em duas partes. Na primeira (capitulo 3) o desenvolvimento, os aspectos morfofisiológicos, histoquímicos e a manifestação endofítica foram avaliados na multiplicação das duas fontes de explante sob diferentes meios e condições de cultivo. Na segunda (capítulo 4) as comunidades bacterianas endofíticas foram analisadas por meio de PCR-DGGE, baseada na região V6 do gene 16S DNAr. Os resultados mostraram que as microcepas provenientes de megaestaca tiveram melhor desenvolvimento independentemente do tratamento e maior frequência de manifestações endofíticas, comparando-se com as de anelamento. As comunidades bacterinas endofíticas foram distintas entre as amostras in vivo e in vitro, e se alteraram ao longo dos subcultivos e nas amostras alongadas e enraizadas. As diferenças existentes no desenvolvimento das microcepas podem ser inerentes à totipotencialidade do material, mas também podem ser afetadas, tanto pela ocorrência de manifestação, quanto pela comunidade bacteriana endofítica mais ou menos sensível ao processo de micropropagação, auxiliando ou prejudicando o desenvolvimento in vitro de seus hospedeiros. Cabe destacar, ainda, que mesmo em um sistema asséptico e ambientalmente controlado, os microrganismos endofíticos que resistiram a todo processo de desinfestação e cultivo, não estão \"adormecidos\", muito pelo contrário podem se alterar em quantidade à medida que seu hospedeiro é submetido a um novo sistema de cultivo (introdução) ou uma nova fase dentro da micropropagação (multiplicação → alongamento e enraizamnento) ou, ainda, ao longo dos subcultivos. Sendo assim, a complexa rede de relações das plantas com seus endófitos não cessa durante o cultivo in vitro, ao contrário mantém-se dinâmica. / Eucalyptus benthamii has proven to be especially advantageous as an alternative culture in cold regions, justifying efforts to establish protocols for micropropagation. However, the matrices are preferably selected when adults (material with lower morphogenic efficiency), making micropropagation more dependent of subcultures and too longer to reverse the material to rejuvenation. Thus, reduction of losses in vitro has deserved attention, such for example the endophytic manifestations that require the maximization of efficiency culture and adjustments to the Protocol, in order to minimize them, enabling better understanding of the relations established and maintained between endophytes and its host along micropropagation. For this, mini-stumps were used from two sources of mini-cuttings collected from the epicormic shoots of mega-cuttings from the treetop base and shoots from girdling from the trunk base, both of one E. benthamii matrix with 13 years of age established in clonal mini garden under greenhouse condition, aimed to evaluate how is the multiplication of two sources of explants (mini-stumps) under different growing conditions; analyze how the endophytic manifestations frequency and intensity are affected by different conditions; investigate the changes to occurrence in the endophytic bacterial community due to the variation of culture conditions and micropropagation phase (in vivo = mini-stumps, and in vitro = micro-stumps, elongated and rooted materials). In order to meet these objectives, the research was divided in two parts. In the first (chapter 3) the development, morphophysiological aspects, histochemical and endophytic manifestation were evaluated in the multiplication of the two explants sources from different media and culture conditions. In the second (chapter 4) endophytic bacterial communities were analyzed by PCR-DGGE based on the V6 region of 16S rDNA gene. The results showed that micro-stumps from mega-cuttings had better development regardless of treatment and increased frequency of endophytic events, comparing with the girdling. Endophytic bacterial communities were different between samples in vivo and in vitro, and have changed over the subcultures and the elongated and rooted samples. The differences in the development of micro-stumps can be explained by the totipotentiality inherent to the material, but may also be affected by both the manifestation occurrence and the endophytic bacterial community more or less sensitive to the micropropagation, helping or harming the in vitro development of their hosts. We also highlight that even in an aseptic and environmentally controlled system, the endophytic microorganisms that resisted the whole process of disinfection and cultivation, are not \"asleep\", quite the opposite may change in quantity when your host is subjected to a new cultivation system (in vitro establishment) and a new phase within the micropropagation (multiplication → stretching and enraizamnento), or even along the subcultures. This way, the complex network of relationships of the plant with their endophyte does not cease during the in vitro culture, unlike remains dynamic.

Dentre as poucas espécies de Eucalyptus que apresentam aptidão ao cultivo em regiões de baixas temperaturas e a geadas frequentes, destacam-se genótipos de Eucalyptus benthamii que representam opções para futuros plantios florestais em diferentes regiões brasileiras. Porém, existem poucas informações quanto a obtenção de mudas clonais, e se focarmos as espécies aconselhadas para o plantio em condições subtropicais, tal carência é ainda maior, principalmente ao considerar os fatores endógenos e exógenos para o enraizamento adventício. Baseado no exposto, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar aspectos morfofisiológicos da clonagem de genótipos de Eucalyptus benthamii por meio das técnicas de miniestaquia e micropropagação. Para tanto, o trabalho foi dividido em quatro estudos básicos. O primeiro estudo (Capítulo 2) baseou-se na avaliação da morfofisiologia de um minijardim clonal em relação a diferentes concentrações de Zn e B ao longo de sucessivas coletas de brotações. O segundo estudo (Capítulo 3) foi baseado em avaliar o enraizamento de miniestacas quanto a diferentes concentrações de Zn e B e aplicação de AIB ao longo de sucessivas coletas de brotações. O terceiro estudo (Capítulo 4) baseou-se em avaliar a dinâmica de enraizamento de miniestacas quanto a diferentes concentrações de AIB, tempo ótimo de permanência de miniestacas enraizadas em casa de vegetação e a origem da conexão vascular da raiz emitida. Por fim, o quarto estudo (Capítulo 5) foi baseado no desenvolvimento e estabelecimento de protocolo para a micropropagação visando a produção de microcepas para formar um microjardim clonal. Em termos gerais, a sobrevivência das minicepas, produção de miniestacas por metro quadrado ao ano e os teores foliares de macro e micronutrientes variaram significativamente em relação as concentrações de Zn e B, apresentando diferentes respostas ao longo das coletas de brotações no minijardim clonal. Os teores foliares de carboidratos solúveis não estruturais variaram significativamente de acordo com as coletas de brotações e solução nutritiva, sendo que o aumento das concentrações de Zn e B na solução nutritiva induziu a redução dos teores de carboidratos solúveis não estruturais. A porcentagem de enraizamento dos materiais clonais foi baixa, sendo considerados de difícil propagação pela miniestaquia. A presença de Zn e B na solução nutritiva (concentrações variando de 1,0 a 2,0 mg L-1) associadas a presença de AIB induziram os maiores índices de enraizamento. A aplicação de AIB na concentração de 2.000 mg L-1 favoreceu a indução de raízes, e o intervalo de 35 a 42 dias foi o mais indicado para a permanência das miniestacas enraizadas em casa de vegetação. De acordo com as análises histológicas da rizogênese foi verificado que a raiz adventícia apresentou conexão direta com o câmbio vascular. A multiplicação in vitro de gemas axilares dependeu do clone, meio de cultura e concentração de regulador de crescimento e, o alongamento de brotações dependeu do clone e regulador de crescimento. O protocolo de micropropagação foi eficiente para a produção de microplantas de Eucalyptus benthamii as quais podem ser usadas para a formação de um microjardim clonal. / Few Eucalyptus species present adaptation for cultivation in regions subject to low temperatures and frequent frosts, and Eucalyptus benthamii genotypes may represent options for future forest plantations in different regions of Brazil, in view of its excellent silvicultural performance in these conditions. However, there is little information on obtaining clones, and considering the species recommended for planting in subtropical conditions, this lack of information is even greater, mainly when considering the endogenous and exogenous factors for the adventitious rooting. Based on these information, the present work was aimed the conducting of studies on morphophysiological aspects during the cloning of Eucalyptus benthamii through of the mini-cuttings and micropropagation techniques. Therefore, the work was divided into four basic studies. The first study (Chapter 2) was based in evaluate the morphophysiology of a clonal mini-garden regarding to Zn and B concentrations during successive shoot collections. The second study (Chapter 3) was based in evaluate the induction of adventitious rooting in mini-cuttings regarding to genotype, Zn and B concentrations, shoot collections and IBA application. The third study (Chapter 4) was based in evaluate the adventitious rooting percentage of selected genotypes regarding the IBA concentration, optimal time of permanence of rooted mini-cuttings in a greenhouse and the origin of the vascular connection. Finally, the fourth study (Chapter 5) was based in develop a method for cloning of selected genotypes through micropropagation technique for the formation of a clonal micro-garden. In overall terms, mini-stumps survival, mini-cuttings production per square meter per year and foliar content of macro and micronutrients varied significantly in relation to treatments, presenting different responses according to shoots collection of the clonal mini-garden. The content of soluble carbohydrates non-structural of leaves varied regarding the shoots collection and nutrient solution. The increasing of the Zn and B concentrations in the nutrient solution induced reduction of the total content of soluble carbohydrates non-structural of leaves. The adventitious rooting percentage was low, and the genotypes were considered difficult to propagation by mini-cuttings technique. The ministumps fertigated with nutrient solutions containing Zn and B (concentrations of 1.0 at 2.0 mg L-1) associated with the IBA application presented the greater adventitious rooting percentage. The IBA application in the concentration of 2,000 mg L-1 resulted in the greater speed of rooting and rooting percentage, and the interval of 35 to 42 days was the most suitable for the permanence of mini-cuttings rooted in a greenhouse. According to the histological analysis of rhizogenesis was verified that the adventitious root presented direct connection to the vascular cambium. The in vitro multiplication of axillary buds depends of the genetic material, culture medium and concentration of plant growth regulator and, the shoots elongation depends of the genetic material and plant growth regulator. The micropropagation protocol was efficient for the microplants production of Eucalyptus benthamii and can be used to form a clonal microgarden.

Eucalyptus benthamii tem se mostrado especialmente vantajoso como alternativa ao cultivo em regiões frias, justificando esforços para o estabelecimento de protocolos para sua micropropagação. Porém, as matrizes são preferencialmente selecionadas quando adultas (material apresenta menor competência morfogênica), tornando a micropropagação dependente de maior número de subcultivos e maior tempo para se reverter o material ao rejuvenescimento. Assim, a redução das perdas in vitro tem merecido atenção, como por exemplo, as manifestações endofíticas, que exigem maximização da eficiência da cultura e adequações no protocolo, visando minimizá-las, possibilitando melhorar o entendimento das relações estabelecidas e mantidas entre os endófitos e seu hospedeiro durante a micropropagação. Dessa maneira, foram utilizadas minicepas provenientes de duas fontes de miniestacas coletadas a partir do brotamento de gemas epicórmicas de megaestacas da base da copa e de brotamentos do anelamento da base do tronco, de uma matriz de E. benthamii com 13 anos de idade, estabelecidas em minijardim clonal sob condição de casa de vegetação, com o objetivo de avaliar como se dá a multiplicação, sob diferentes condições de cultivo, das duas fontes de explantes (minicepas); analisar se a frequência e intensidade das manifestações endofíticas são afetadas pelas diferentes condições de cultivo; investigar a ocorrência de alterações na comunidade bacteriana endofítica devido à alteração das condições de cultivo e fase da micropropagação (in vivo = minicepas, e in vitro = microcepas, material alongado e enraizado). Visando atender estes objetivos, a pesquisa se dividiu em duas partes. Na primeira (capitulo 3) o desenvolvimento, os aspectos morfofisiológicos, histoquímicos e a manifestação endofítica foram avaliados na multiplicação das duas fontes de explante sob diferentes meios e condições de cultivo. Na segunda (capítulo 4) as comunidades bacterianas endofíticas foram analisadas por meio de PCR-DGGE, baseada na região V6 do gene 16S DNAr. Os resultados mostraram que as microcepas provenientes de megaestaca tiveram melhor desenvolvimento independentemente do tratamento e maior frequência de manifestações endofíticas, comparando-se com as de anelamento. As comunidades bacterinas endofíticas foram distintas entre as amostras in vivo e in vitro, e se alteraram ao longo dos subcultivos e nas amostras alongadas e enraizadas. As diferenças existentes no desenvolvimento das microcepas podem ser inerentes à totipotencialidade do material, mas também podem ser afetadas, tanto pela ocorrência de manifestação, quanto pela comunidade bacteriana endofítica mais ou menos sensível ao processo de micropropagação, auxiliando ou prejudicando o desenvolvimento in vitro de seus hospedeiros. Cabe destacar, ainda, que mesmo em um sistema asséptico e ambientalmente controlado, os microrganismos endofíticos que resistiram a todo processo de desinfestação e cultivo, não estão \"adormecidos\", muito pelo contrário podem se alterar em quantidade à medida que seu hospedeiro é submetido a um novo sistema de cultivo (introdução) ou uma nova fase dentro da micropropagação (multiplicação → alongamento e enraizamnento) ou, ainda, ao longo dos subcultivos. Sendo assim, a complexa rede de relações das plantas com seus endófitos não cessa durante o cultivo in vitro, ao contrário mantém-se dinâmica. / Eucalyptus benthamii has proven to be especially advantageous as an alternative culture in cold regions, justifying efforts to establish protocols for micropropagation. However, the matrices are preferably selected when adults (material with lower morphogenic efficiency), making micropropagation more dependent of subcultures and too longer to reverse the material to rejuvenation. Thus, reduction of losses in vitro has deserved attention, such for example the endophytic manifestations that require the maximization of efficiency culture and adjustments to the Protocol, in order to minimize them, enabling better understanding of the relations established and maintained between endophytes and its host along micropropagation. For this, mini-stumps were used from two sources of mini-cuttings collected from the epicormic shoots of mega-cuttings from the treetop base and shoots from girdling from the trunk base, both of one E. benthamii matrix with 13 years of age established in clonal mini garden under greenhouse condition, aimed to evaluate how is the multiplication of two sources of explants (mini-stumps) under different growing conditions; analyze how the endophytic manifestations frequency and intensity are affected by different conditions; investigate the changes to occurrence in the endophytic bacterial community due to the variation of culture conditions and micropropagation phase (in vivo = mini-stumps, and in vitro = micro-stumps, elongated and rooted materials). In order to meet these objectives, the research was divided in two parts. In the first (chapter 3) the development, morphophysiological aspects, histochemical and endophytic manifestation were evaluated in the multiplication of the two explants sources from different media and culture conditions. In the second (chapter 4) endophytic bacterial communities were analyzed by PCR-DGGE based on the V6 region of 16S rDNA gene. The results showed that micro-stumps from mega-cuttings had better development regardless of treatment and increased frequency of endophytic events, comparing with the girdling. Endophytic bacterial communities were different between samples in vivo and in vitro, and have changed over the subcultures and the elongated and rooted samples. The differences in the development of micro-stumps can be explained by the totipotentiality inherent to the material, but may also be affected by both the manifestation occurrence and the endophytic bacterial community more or less sensitive to the micropropagation, helping or harming the in vitro development of their hosts. We also highlight that even in an aseptic and environmentally controlled system, the endophytic microorganisms that resisted the whole process of disinfection and cultivation, are not \"asleep\", quite the opposite may change in quantity when your host is subjected to a new cultivation system (in vitro establishment) and a new phase within the micropropagation (multiplication → stretching and enraizamnento), or even along the subcultures. This way, the complex network of relationships of the plant with their endophyte does not cease during the in vitro culture, unlike remains dynamic.