La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale, ou FSHD, est une maladie d'hérédité autosomique dominante, caractérisée par un affaiblissement des muscles de la face, et progressant de façon asymétrique au reste du corps. Des analyses de liaison ont montré que 95% des cas sont associés à la délétion de D4Z4, macrosatellite polymorphe de 3,3Kb, répété en tandem dans la région subtélomérique du bras long du chromosome 4, mais aucun gène candidat n'a clairement été identifié, et l'existence de patients sans contraction (FSHD2), suggère des mécanismes complexes dans la survenue de la maladie. Parmi ceux-ci, l'implication d'altérations épigénétique a été suggérée. En effet, des changements de marques épigénétiques chez les patients, tels que l'hypométhylation de l'ADN et la diminution de la triméthylation des résidus H3K9, indiquent que des modifications de l'organisation chromatinienne et des altérations épigénétiques interviendraient dans la FSHD. De plus la localisation particulière du locus 4q35 dans le noyau pourrait contribuer à la régulation de ce locus. La disposition et la localisation des gènes n'est pas aléatoire au sein du noyau, c'est un processus dynamique impliqué dans la régulation des gènes au cours de la prolifération cellulaire et la différenciation. L'objectif nos travaux a donc été de comprendre la conformation tridimensionnelle du locus 4q35 chez les malades et les individus non atteints, pour déterminer de potentielles interactions entre séquences, proches ou distantes, impliquées dans la survenue de la FSHD. / Facio-Scapulo-Humeral-Dystrophy (FSHD) is an autosomal dominant, neuromuscular disorder, characterized by facial muscular weakness with an asymmetric progression to the rest of the body. Linkage analyses have shown that 95% of cases are associated with D4Z4 deletion, a 3.3 kb tandemly repeated sequence located in the subtelomeric region of the long arm of chromosome 4, 4q35. However, no candidate gene has been clearly identified, and families with typical FSHD phenotype, but no linkage to 4q35 (FSHD2) suggest complex epigenetic mechanisms. The deletion of a certain number of this repetitive DNA sequence associated to changes in the epigenetic marks across the D4Z4 array such as DNA hypomethylation or decrease in H3K9 trimethylation also indicates that FSHD involves changes in chromatin organization and epigenetic alterations. Among these changes, the positioning of the 4q35 region within the nuclear space might contribute to the regulation of the disease-associated locus. Indeed, DNA sequences are not randomly distributed within the nuclear space and gene localization is a dynamic process that contributes to the control of gene expression during cell proliferation and differentiation. The aim of our study was to compare chromatin conformation of the 4q35 locus in patients and unaffected individuals, and to identify interactions between sequences, in close proximity or distant to the D4Z4 array in FSHD pathogenesis. Therefore, we have developed an immuno-FISH technique in 3D, in different cellular models, in order to study the tridimensional distribution of DNA sequences within the nuclear volume.

La régulation de l’expression génique chez les mammifères dépend de l’organisation tridimensionnelle des chromosomes, en particulier à l’échelle des communications entre les séquences régulatrices et leurs promoteurs cibles. Ainsi, les chromosomes sont organisés en une nouvelle architecture consistant en domaines d’interactions topologiques (TADs, acronyme anglais). Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans cette architecture et leurs importances au cours du développement embryonnaire, pour un locus bien particulier, le Xic (acronyme anglais pour X-inactivation centre). Le Xic contient les éléments régulateurs nécessaires pour initier l’inactivation du chromosome X (ICX), un phénomène épigénétique spécifique du développement des mammifères femelles, rendant l’un des deux chromosomes X inactif du point de vue transcriptionnelle. L’ICX permet d’égaliser l’expression des gènes liés au X entre les sexes chez les mammifères. Le Xic est organisé au moins en deux TADs mais une partie du locus reste encore non identifiée. Je présente ici une analyse fonctionnelle approfondie des différents éléments régulateurs au sein du Xic, comprenant des enhancers, des gènes d’ARNs non codants et des éléments structurels. Après avoir créé une série d’allèles mutés chez la souris et les cellules souches embryonnaires murines, j’ai caractérisé l’impact de ces réarrangements génomiques sur le paysage structurel et transcriptionnel du Xic. J’ai identifié des nouveaux acteurs dans la régulation de ce locus, en particulier des séquences régulatrices conservées chez les mammifères placentaires et des éléments structurels importants pour la formation d’une frontière entre les deux TADs du Xic, importante pour leur séparation et régulation. Je décris aussi la découverte de communication entre ces TADs, ce qui constitue un mécanisme inédit de régulation génique pendant le développement. Ce travail contribue à un nouveau niveau de compréhension des lois qui régissent l’organisation des TADs dans le contexte de la régulation génique chez les mammifères. / Mammalian gene regulatory landscapes rely on the folding of chromosomes in the recently discovered topologically associating domains (TADs), which ensure appropriate communication between cis-regulatory elements and their target promoters. The aim of my PhD project was to characterise the molecular mechanisms that govern this novel architecture and its functional importance in the context of a critical and developmentally regulated locus, the X-inactivation centre (Xic). The Xic contains the necessary elements to trigger X-chromosome inactivation, an epigenetic phenomenon that occurs during the development of female mammals to transcriptionally silence one of the X-chromosomes and equalise X-linked gene expression between sexes. The Xic is partitioned into at least two TADs, but its full extent is unknown. Here, I present a comprehensive functional analysis of different cis-regulatory elements within the Xic, including enhancer-like regions, long noncoding RNA loci and structural elements. Upon generating a series of mutant alleles in mice and murine embryonic stem cells, I characterised the impact of these genomic rearrangements in the structural and transcriptional landscape of the Xic and identified novel players in the regulation of this locus, including cis-acting elements conserved across placental mammals and structural elements critical for the insulation between the Xic TADs. I also found evidence for communication across TADs at this locus, which provides new insights into how regulatory landscapes can work during development. This study also extends our understanding of the rules governing the organisation of TADs and their chromatin loops in the context of mammalian gene regulation. / Nos mamíferos, a regulação da expressão genética depende da organização tridimensional dos cromosomas, em particular ao nível da comunicação regulatória entre promotores e enhancers. A esta escala, descobriu-se recentemente que os cromossomas estão organizados em domínios de interações topológicas (conhecidos como TADs, no acrónimo inglês) que se pensa providenciarem uma base estrutural para as paisagens de regulação transcricional dos genes. O meu projecto de tese teve como objectivo caracterizar os mecanismos moleculares responsáveis por esta arquitectura e a sua importância funcional no contexto de um locus crítico para o desenvolvimento embrionário, o centro de inactivação do cromossoma X (Xic, acrónimo inglês). O Xic contém os elementos genéticos necessários e suficientes para iniciar a inactivação do cromossoma X, um fenómeno epigenético que ocorre durante o desenvolvimento das fêmeas de mamíferos para silenciar um dos cromosomas X e igualar a expressão dos genes do X entre indivíduos XX e XY. O Xic está organizado em pelo menos dois TADs, mas o seu intervalo genético completo permanece desconhecido. Apresento nesta tese uma análise funcional e detalhada de diferentes sequências reguladoras presentes no Xic, incluindo regiões do tipo enhancer, genes de ARNs não codificantes e elementos estruturais. Após a criação de diversos alelos mutantes (deleções, inserções, inversões) em ratinho e em células estaminais embrionárias, através das recentes técnicas de engenharia genética, TALENs e CRISPR/Cas9, caracterizei o impacto destes rearranjos genéticos na paisagem topológica e transcricional do Xic, o que permitiu a identificação de novos actores moleculares na regulação deste locus. Em particular, descobrimos sequências de regulação transcricional altamente conservadas em mamíferos placentários e elementos estruturais importantes para a formação da fronteira entre os dois TADs do Xic. Descrevo também evidência de que há comunicação entre os dois TADs neste locus, o que compromete os modelos actuais do modus operandis dos TADs, e por isso contribui para um novo nível de compreensão dos mecanismos que regulam a expressão genética durante o desenvolvimento.