Ischemic heart disease is a major cause of death worldwide. Identifying the mechanisms mediating cardiac resistance to injury (‘cardioprotection’) can contribute to therapies for cardiac injury. These studies investigated the role of the membrane channel forming protein connexin43 (Cx43), a downstream effector of PKCε-mediated cardioprotection. In isolated cardiomyocytes FGF-2/PKCε –induced cytoprotection is mediated by Cx43 phosphorylation at PKCε-target site, serine(S)262. Hypothesis (1). PKCε-mediated cardioprotection increases Cx43 phosphorylation at PKCε-target sites and prevents ischemia and/or reperfusion-induced Cx43 remodeling. Rat hearts were subjected to protective treatments (ischemic preconditioning, FGF-2, diazoxide), followed by 30 min global ischemia and/or 60 min reperfusion. All treatments elicited above-physiological levels of phospho(p)S262-Cx43 and pS368-Cx43 (P*Cx43), which were sustained during global ischemia, and reperfusion, and accompanied by attenuation of ischemia-induced Cx43 dephosphorylation, and prevention of Cx43 lateralization. Cx43 is present in cardiac subsarcolemmal (SSM) but not interfibrillar (IFM) mitochondria. Hypothesis (2). FGF-2 exerts protective effects on both mitochondrial populations, but is associated with mitochondrial (mito) P*Cx43 state in SSM, and mediated by mitoCx43 function. FGF-2 treatment increased calcium tolerance in SSM and IFM by 2.9- and 1.7-fold, respectively, compared to controls. In the presence of Gap27, a Cx43 hemi-channel blocker, the salutary effect of FGF-2 were lost in SSM but not IFM, indicating a functional role for Cx43. FGF-2 increased levels of PKCε, pPKCε and Tom-20 translocase in SSM and IFM. In SSM, FGF-2 increased pS262-and pS368-Cx43 by 30-fold and 8-fold, compared to controls. Stimulation of untreated SSM with a PKC activator (phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA) also increased pS262-and-S368-Cx43 and calcium tolerance, which was prevented by εV1-2, a PKCε-inhibiting peptide. The effect of FGF-2 on isolated cardiac mitochondria is unknown. Hypothesis (3). FGF-2 exerts a direct protective effects on SSM. Direct stimulation of SSM with FGF-2 increased pS262-and-S368-mitoCx43, and calcium resistance to mPTP, and was dependent on mitoPKCε. FGF receptor inhibitors, SU5402 and FGFR neutralizing antibodies, blocked the effect of FGF-2, suggesting a FGFR1-like protein is responsible for the direct protective effects of FGF-2. This new intracellular mechanism of cytoprotection implies that endogenous intracellular levels of FGF-2 may determine constitutive levels of cardiac mitochondrial resistance to mPTP.

Gap Junctions als wichtigste Elemente der Zelle zur Ermöglichung einer interzellulären Kommunikation erlauben eine koordinierte Antwort auf externe und interne Stimuli und somit ein Zusammenspiel von Zellgruppen und Organen im Gesamtorganismus. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss einer mittelfristigen und chronischen Stimulation neonataler Rattenkardiomyozyten durch Insulin und den Wachstumsfaktoren Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Transforming Growth Factor-β (TGF-β) und Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) auf die Expression der Connexine 40, 43 und 45 untersucht. Dabei zeigte sich unter der Insulin-Stimulation eine konzentrationsabhängige Regulation der Connexin 43 (Cx43) Expression. Die Exposition gegenüber IGF-1 hatte einen signifikanten Anstieg der Cx43 Proteinmenge zur Folge. Unter 24stündiger VEGF- oder FGF-2-Stimulation fand sich dagegen diesbezüglich kein relevanter Unterschied. Die Analysen nach langfristiger Exposition gegebenüber TGF-β zeigten eine signifikante Abnahme der Cx43 Proteinmenge bei unveränderter Cx43 mRNA. Zur Erfassung mittelfristiger Veränderungen wurden die Kardiomyozyten jeweils 3 Stunden mit den Wachstumsfaktoren VEGF und TGF-β inkubiert. Dabei zeigte sich jeweils eine signifikante Zunahme der Cx43 Proteinmenge und –mRNA. Die Connexine 40 und 45 waren in den ventrikulären Kardiomyozyten nur spärlich nachweisbar und durch keinen der untersuchten Faktoren signifikant induzierbar.

Connexin 43 (Cx43) is a gap junction protein that enables direct cell-to-cell communication in many tissues of the body and stressful environments such as injury and hypoxia affect its expression. In addition to affecting Cx43 expression, hypoxia also retards wound-healing rates. Using rat corneal organ cultures, this thesis aims to define hypoxia's role in the expression and localization of Cx43 in wounded corneas. Tissue samples were stained immunohistochemically at three different time points after injury, 2.5 hours, 5 hours, and 18 hours. It was determined that under hypoxic conditions, Cx43 is more highly expressed than under normoxic conditions after injury. While Cx43 expression follows the same spatial pattern throughout the healing process in the cornea under both normoxic and hypoxic conditions, the pattern is delayed under hypoxic conditions. These results provide a possible reason why wound closure is delayed in low oxygen environments.

Dissertation (Ph.D.).--University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at San Antonio, 2007. / Vita. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2000. / Includes bibliographical references (leaves 174-192). Also available online through Digital Dissertations.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Old age is associated with increased bone fragility and risk of fracture as a result of skeletal alterations, including low bone density and cortical thinning. Further, apoptotic osteocytes accumulate in old mice and humans. We have previously shown that mice lacking osteocytic connexin (Cx) 43 (Cx43ΔOt) exhibit a phenotype similar to that of the aging skeleton, with elevated osteocyte apoptosis and an associated increase in osteoclastogenesis. These findings suggest that osteocyte apoptosis results in the release of factors that recruit osteoclasts to bone surfaces close to areas that contain apoptotic osteocytes. However, the specific chemotactic signals, the events mediating their release, and the mechanisms of their action remain unknown. Consistent with this notion, we also found that HMGB1 released by Cx43-deficient (Cx43def) MLO-Y4 osteocytic cells enhances osteoclastogenesis in part by increasing osteocytic RANKL, which promotes osteoclastogenesis, and, at the same time, directly stimulating osteoclastogenesis. Further, expression of the pro-survival microRNA (miR), miR21, is low in Cx43def cells and bones from old female mice, and low miR21 levels increase osteocyte apoptosis. However, surprisingly, mice lacking miR21 (miR21ΔOt) have decreased osteoclast number and activity even under conditions of elevated osteocyte apoptosis; suggesting that osteocytic miR21 may mediate osteoclast precursor recruitment/survival induced by apoptotic osteocytes. However, whether HMGB1/miR21 are released by osteocytes, and if the HMGB1 receptors, receptor for advanced glycation end products (RAGE) and/or tolllike receptor (TLR4) are involved in osteoclast recruitment in Cx43ΔOt and old mice is unknown. The overall objectives of this series of studies were to elucidate the mechanisms

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Die vorgelegte Dissertationsschrift dient der Identifizierung des Mechanismus, über welchen neonatale Kardiomyozyten der Ratte biaxialen zyklischen Stretch wahrnehmen. Angriffspunkt dafür bildeten sowohl Stretch Activated Ion Channels (SAIC) als auch die mit Integrinen assoziierte Focal Adhesion Kinase (FAK). Die Inhibition der SAIC erfolgte mit Gadolinium und eine Blockade der FAK konnte durch den FAK-Inhibitor II erreicht werden. Eigens angelegte Zellkulturen wurden unter definierten Parametern für 24 Stunden unter Einwirkung genannter Stoffe gestretcht und anschließend einer Analyse mittels Immunfluoreszenz und Western Blot unterzogen. Gestretchte Kardiomyozyten richteten sich schräg zur Achse der einwirkenden Kraft aus und wiesen eine Polarisierung von Connexin 43 auf, außerdem zeigte sich dessen gesteigerte Expression. Durch die Blockade der FAK konnte lediglich eine aufgehobene Polarisierung von Connexin 43 bei unveränderter Expression und Ausrichtung der Kardiomyozyten festgestellt werden. Auch die Mikrotubuli veränderten nach Stretch ihre Orientierung bezogen auf die Zellachse. Die zunächst annähernde Parallelität der Fasern zeigte sich nach Inhibition der FAK deutlich aufgelockert. Für die Aktinfilamente konnte dies nicht nachgewiesen werden. Die Integrine dienen demnach der Wahrnehmung von Stretch und vermitteln die Polarisierung von Connexin 43 sowie die Orientierung der Mikrotubuli über die FAK. Für die anderen genannten Prozesse ist die Aktivierung eines FAK-unabhängigen Integrin-Signalweges denkbar. Gadolinium hatte insgesamt keinen Effekt auf beschriebene Veränderungen, sodass ein Einfluss der SAIC auf Stretch-induzierte Veränderungen in Kardiomyozyten ausgeschlossen werden konnte. Gleichzeitig konnte durch die Beobachtung der Polarisierung von Microtubule Organizing Center, Kinesin und Golgi-Apparat die Hypothese der sich durch Stretch orientierenden neonatalen Kardiomyozyte unterstützt werden, welche die Voraussetzung für die Anordnung von Connexin 43 an den Zellpolen darstellen könnte. Sowohl die Selbstorganisation des Myokards im Rahmen der Embryogenese als auch die Pathophysiologie verschiedener kardialer Erkrankungen könnte dadurch womöglich besser verstanden werden.

In der vorliegenden Arbeit wurden Myokardproben des rechtsventrikulären Ausflusstraktes von Patienten mit Fallot’scher Tetralogie sowie Double Outlet Right Ventricle vom Fallot - Typ untersucht. Hintergrund der Studie waren Untersuchungen anderer Autoren an Cx43 - knock - out Mäusen, die dort Veränderungen des kardialen Phänotyps beschrieben, die sie als Fallot - artig interpretierten. Daraus wurde die Hypothese entwickelt, dass Änderungen auf der Ebene des Connexin 43 ursächlich mit der Fallot’schen Tetralogie verbunden sein könnten. Es erfolgte eine histologische Analyse von 25 Patientenproben im Hinblick auf die Lokalisation von Connexin 43 sowie N - Cadherin. Es zeigte sich eine altersabhängige Verteilung von Connexin 43 und N - Cadherin. Insbesondere Patienten der Gruppe 1 (jünger als zwei Jahre) zeigten eine Verteilung sowohl an der lateralen Zellseite, als auch am Pol der Kardiomyozyten. Mit zunehmendem Alter beschränkten sich sowohl Connexin 43 als auch N - Cadherin auf die Disci intercalares zwischen den Kardiomyozyten und befanden sich dort in enger Nachbarschaft zueinander. Des Weiteren erfolgte eine Analyse der codierenden Region des Connexin 43 Gens mittels High Resolution Melting - PCR und sich daran anschließender Sequenzierung. Es zeigten sich sowohl bei den Kontrollen als auch den Patienten bereits bekannte Single Nucleotide Polymorphismen sowie bis dato unbekannte Sequenzvariationen. Allerdings wurden keine homozygoten Veränderungen der DNA festgestellt. Auch fand sich keine der heterozygoten Veränderungen in allen untersuchten Patienten. Somit ist es unwahrscheinlich, dass ein einzelner Basenaustausch zum komplexen Krankheitsbild der Fallot’schen Tetralogie beziehungsweise zum Double Outlet Right Ventricle vom Fallot - Typ führt.

Gap Junctions als wichtigste Elemente der Zelle zur Ermöglichung einer interzellulären Kommunikation erlauben eine koordinierte Antwort auf externe und interne Stimuli und somit ein Zusammenspiel von Zellgruppen und Organen im Gesamtorganismus. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss einer mittelfristigen und chronischen Stimulation neonataler Rattenkardiomyozyten durch Insulin und den Wachstumsfaktoren Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Transforming Growth Factor-β (TGF-β) und Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) auf die Expression der Connexine 40, 43 und 45 untersucht. Dabei zeigte sich unter der Insulin-Stimulation eine konzentrationsabhängige Regulation der Connexin 43 (Cx43) Expression. Die Exposition gegenüber IGF-1 hatte einen signifikanten Anstieg der Cx43 Proteinmenge zur Folge. Unter 24stündiger VEGF- oder FGF-2-Stimulation fand sich dagegen diesbezüglich kein relevanter Unterschied. Die Analysen nach langfristiger Exposition gegebenüber TGF-β zeigten eine signifikante Abnahme der Cx43 Proteinmenge bei unveränderter Cx43 mRNA. Zur Erfassung mittelfristiger Veränderungen wurden die Kardiomyozyten jeweils 3 Stunden mit den Wachstumsfaktoren VEGF und TGF-β inkubiert. Dabei zeigte sich jeweils eine signifikante Zunahme der Cx43 Proteinmenge und –mRNA. Die Connexine 40 und 45 waren in den ventrikulären Kardiomyozyten nur spärlich nachweisbar und durch keinen der untersuchten Faktoren signifikant induzierbar.