Este trabalho descreve o desenvolvimento de um biossensor contendo transdução condutométrica sem contato (C4D, capacitively coupled contactless conductivity detection) e ácido fólico (FA) como biorreceptor em microchip, uma nova alternativa que poderá ser utilizada na determinação do biomarcador tumoral FR-α. Essa espécie exibe interações com FA altamente específicas, com constantes de formação da ordem de 109-1010. Os dispositivos microfluídicos, os quais consistiram de uma lâmina de vidro (integrando os eletrodos), dielétrico (contendo a fase biossensora) e substrato de poli(dimetilsiloxano) (PDMS, incorporando os microcanais), foram fabricados utilizando-se processos de fotolitografia e deposição de filmes finos em fase vapor. Objetivando melhorias nos níveis de detecção da C4D, estudos de sensibilidade com base em parâmetros da curva analítica foram conduzidos alterando-se a natureza do dielétrico e a configuração dos eletrodos. Posteriormente, estudos de caracterização foram realizados para as superfícies modificadas com os intermediários de imobilização; condições reacionais distintas (reagente, concentração, solvente e tempo) foram consideradas. As técnicas de microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios-X foram usadas, respectivamente, a fim de se verificar a possível formação de aglomerados e permitir determinações qualitativas e quantitativas sobre as composições químicas das superfícies. Como resultado dos experimentos de sensibilidade e caracterização de superfície, adotamos os parâmetros seguintes para os ensaios de interações biomoleculares posteriores: filme de SiO2 como dielétrico, eletrodos seletivos à C4D com formato retangular e orientação antiparalela e monocamadas automontadas do reagente 3-aminopropil(trietoxisilano) como intermediário de imobilização de FA. As duas etapas finais do trabalho foram: otimização do tempo de funcionalização com FA (3, 5 e 7 h) e caracterização da fase biossensora, realizada a partir de medidas de C4D e microscopia de força atômica (AFM). Para o primeiro caso, os microchips foram aplicados a um padrão de anticorpo monoclonal específico a FA (α-FA). Os ensaios biomoleculares indicaram uma adsorção efetiva de FA junto à superfície de SiO2 silanizada, sem a ocorrência (ao menos em níveis significativos) de impedimentos estéricos de sua espécie bioativa. Dentre os tempos de funcionalização investigados, 3 h foi aquele que resultou em uma maior sensibilidade do método. Em termos da etapa de caracterização eletroquímica da fase biossensora, seus resultados mostraram haver correlação entre a resposta analítica e as interações FA/α-FA. Em adição, conforme indicaram as medidas de AFM, não houve alterações drásticas na morfologia do substrato (SiO2) em função dos processos de modificação química de superfície. Por fim, o uso da C4D como uma técnica de transdução em biossensores mostrou-se uma alternativa promissora para a análise do biomarcador tumoral FR-α. Dentre outros aspectos, essa plataforma analítica requer uma instrumentação simples, barata e portátil, não apresenta inconvenientes relacionados ao contato eletrodo/solução, dispensa o uso de mediadores redox e permite a determinação simultânea de multianalitos. Neste ínterim, alterações no transdutor devem ser implementadas visando um aumento na sensibilidade do método, o qual representa seu fator limitante principal. / This work describes the development of a biosensor containing capacitively coupled contactless conductivity transduction (C4D) and folic acid (FA) as bioreceptor in microchip, a new alternative that can be used in FR-α tumor biomarker analysis. FR-α exhibits highly specific interactions with FA, showing formation constants of the order of 109-1010. The microfluidic devices consisted of a glass layer (integrating the electrodes), dielectric (containing the biosensor phase), and poly(dimetilsiloxane) substrate (PDMS, incorporating microchannel). The microfabrication stage evolved photolithography processes, metal adsorption via sputtering, and plasma-enhanced vapor film deposition. In order to improve detection levels of C4D, sensitivity studies were conducted by changing the dielectric nature and electrode configuration. Through flow analysis with given electrolyte standards, the limits of detection and quantification were calculated based on analytical curve parameters. Subsequently, researches were performed to characterize the modified surfaces with immobilization intermediate considering reaction conditions distinct (reagent, concentration, solvent, and time). The techniques of scanning electron microscopy and X-ray photoelectron spectroscopy were employed, respectively, aiming to verify the clusters formation and allow qualitative and quantitative determinations about the surfaces chemical composition. From the results of sensitivity experiments and surface characterization, we adopt the following parameters for the biomolecular interactions assays: SiO2 film as dielectric, C4D selective electrodes with rectangular shape and antiparallel orientation, and self-assembled monolayers of 3-aminopropyl(triethoxysilane) as intermediary for immobilization of FA. The two final steps of the work were: optimizing the FA functionalization time (3, 5, and 7 h) and phase biosensor characterization, made from measures of C4D and atomic force microscopy (AFM). For the first case, due to the absence of FR-α standard for purchase, the microchips were applied to FA specific monoclonal antibody (α-FA). The biomolecular assay indicated effective adsorption of FA, without occurrence (at least in significant levels) of steric hindrance of its bioactive specie. Among the investigated times of functionalization, 3 h resulted in a higher sensitivity of the method. In terms of biosensor phase electrochemical characterization stage, their results evidenced correlation between analytical response and FA/α-FA interactions. Additionally, as the AFM measurements showed, drastic changes in the morphology of the substrate (SiO2) with the surface modification processes did not occur. Finally, the use of the C4D as transduction technical in biosensors proved to be a promissory alternative for FR-α tumor biomarker analysis. Among other features, this platform has not drawbacks related to the electrode/solution contact, dispenses the use of redox mediators, allows the simultaneous determination of multianalytes, and employs an instrumentation that is simple, cheap, and portable. Nevertheless, changes in the transducer should be implemented to increase the method sensitivity, which represents its main limiting factor.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um biossensor contendo transdução condutométrica sem contato (C4D, capacitively coupled contactless conductivity detection) e ácido fólico (FA) como biorreceptor em microchip, uma nova alternativa que poderá ser utilizada na determinação do biomarcador tumoral FR-α. Essa espécie exibe interações com FA altamente específicas, com constantes de formação da ordem de 109-1010. Os dispositivos microfluídicos, os quais consistiram de uma lâmina de vidro (integrando os eletrodos), dielétrico (contendo a fase biossensora) e substrato de poli(dimetilsiloxano) (PDMS, incorporando os microcanais), foram fabricados utilizando-se processos de fotolitografia e deposição de filmes finos em fase vapor. Objetivando melhorias nos níveis de detecção da C4D, estudos de sensibilidade com base em parâmetros da curva analítica foram conduzidos alterando-se a natureza do dielétrico e a configuração dos eletrodos. Posteriormente, estudos de caracterização foram realizados para as superfícies modificadas com os intermediários de imobilização; condições reacionais distintas (reagente, concentração, solvente e tempo) foram consideradas. As técnicas de microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios-X foram usadas, respectivamente, a fim de se verificar a possível formação de aglomerados e permitir determinações qualitativas e quantitativas sobre as composições químicas das superfícies. Como resultado dos experimentos de sensibilidade e caracterização de superfície, adotamos os parâmetros seguintes para os ensaios de interações biomoleculares posteriores: filme de SiO2 como dielétrico, eletrodos seletivos à C4D com formato retangular e orientação antiparalela e monocamadas automontadas do reagente 3-aminopropil(trietoxisilano) como intermediário de imobilização de FA. As duas etapas finais do trabalho foram: otimização do tempo de funcionalização com FA (3, 5 e 7 h) e caracterização da fase biossensora, realizada a partir de medidas de C4D e microscopia de força atômica (AFM). Para o primeiro caso, os microchips foram aplicados a um padrão de anticorpo monoclonal específico a FA (α-FA). Os ensaios biomoleculares indicaram uma adsorção efetiva de FA junto à superfície de SiO2 silanizada, sem a ocorrência (ao menos em níveis significativos) de impedimentos estéricos de sua espécie bioativa. Dentre os tempos de funcionalização investigados, 3 h foi aquele que resultou em uma maior sensibilidade do método. Em termos da etapa de caracterização eletroquímica da fase biossensora, seus resultados mostraram haver correlação entre a resposta analítica e as interações FA/α-FA. Em adição, conforme indicaram as medidas de AFM, não houve alterações drásticas na morfologia do substrato (SiO2) em função dos processos de modificação química de superfície. Por fim, o uso da C4D como uma técnica de transdução em biossensores mostrou-se uma alternativa promissora para a análise do biomarcador tumoral FR-α. Dentre outros aspectos, essa plataforma analítica requer uma instrumentação simples, barata e portátil, não apresenta inconvenientes relacionados ao contato eletrodo/solução, dispensa o uso de mediadores redox e permite a determinação simultânea de multianalitos. Neste ínterim, alterações no transdutor devem ser implementadas visando um aumento na sensibilidade do método, o qual representa seu fator limitante principal. / This work describes the development of a biosensor containing capacitively coupled contactless conductivity transduction (C4D) and folic acid (FA) as bioreceptor in microchip, a new alternative that can be used in FR-α tumor biomarker analysis. FR-α exhibits highly specific interactions with FA, showing formation constants of the order of 109-1010. The microfluidic devices consisted of a glass layer (integrating the electrodes), dielectric (containing the biosensor phase), and poly(dimetilsiloxane) substrate (PDMS, incorporating microchannel). The microfabrication stage evolved photolithography processes, metal adsorption via sputtering, and plasma-enhanced vapor film deposition. In order to improve detection levels of C4D, sensitivity studies were conducted by changing the dielectric nature and electrode configuration. Through flow analysis with given electrolyte standards, the limits of detection and quantification were calculated based on analytical curve parameters. Subsequently, researches were performed to characterize the modified surfaces with immobilization intermediate considering reaction conditions distinct (reagent, concentration, solvent, and time). The techniques of scanning electron microscopy and X-ray photoelectron spectroscopy were employed, respectively, aiming to verify the clusters formation and allow qualitative and quantitative determinations about the surfaces chemical composition. From the results of sensitivity experiments and surface characterization, we adopt the following parameters for the biomolecular interactions assays: SiO2 film as dielectric, C4D selective electrodes with rectangular shape and antiparallel orientation, and self-assembled monolayers of 3-aminopropyl(triethoxysilane) as intermediary for immobilization of FA. The two final steps of the work were: optimizing the FA functionalization time (3, 5, and 7 h) and phase biosensor characterization, made from measures of C4D and atomic force microscopy (AFM). For the first case, due to the absence of FR-α standard for purchase, the microchips were applied to FA specific monoclonal antibody (α-FA). The biomolecular assay indicated effective adsorption of FA, without occurrence (at least in significant levels) of steric hindrance of its bioactive specie. Among the investigated times of functionalization, 3 h resulted in a higher sensitivity of the method. In terms of biosensor phase electrochemical characterization stage, their results evidenced correlation between analytical response and FA/α-FA interactions. Additionally, as the AFM measurements showed, drastic changes in the morphology of the substrate (SiO2) with the surface modification processes did not occur. Finally, the use of the C4D as transduction technical in biosensors proved to be a promissory alternative for FR-α tumor biomarker analysis. Among other features, this platform has not drawbacks related to the electrode/solution contact, dispenses the use of redox mediators, allows the simultaneous determination of multianalytes, and employs an instrumentation that is simple, cheap, and portable. Nevertheless, changes in the transducer should be implemented to increase the method sensitivity, which represents its main limiting factor.

This work deals with dual detection of organic and inorganic analytes after separation by capillary zone electrophoresis. In the first part, two types of hydrodynamic sampling are tested. Standard hydrodynamic sampling most often used in laboratory-made electrophoretic apparatus, based on lifting the vessel with the sample, in which the sampling end of the capillary is immersed, and a new method based on increasing the pressure in the sampling vessel without moving the capillary. This sampling procedure minimizes experimenter activity because it is controlled by software. Experimenter only changes vessel containing the sample solution for one with separation electrolyte. The experimental parameters, the sampling time and pressure, are optimized to achieve maximum separation efficiency and adequate detection sensitivity. In the second part of the work, the developed method is tested for the separation of amino-acids in a biological sample (urine).

Capillary zone electrophoresis is an analytical method frequently used in many laboratories for solving various analytical problems. This diploma thesis describes one of many applications of capillary zone electrophoresis using a unique laboratory apparatus composed of a short capillary and dual conductivity/UV detector placed in one detection point of the separation capillary. In the first part of this thesis, the laboratory apparatus was tested by the separation of small inorganic and organic ions. Sodium, potassium, tyramine and histidine ions were used to test the two parts of the dual detector. Experimentally obtained mobilities of these ions were compared with those calculated from the tabulated values. In the second part, the apparatus was used for determination of analytes in samples with more complex matrixces, pharmaceuticals Acylcoffin and B-komplex produced by Zentiva, a.s. One analyte was chosen from each pharmaceutical preparation for determination of its concentration in the preparation, caffeine from Acylcoffine and thiamine from B-komplex. The concentrations were calulated using three different calibration methods and the experimentally obtained values were compared with those specified by the pharmaceuticals producer. Key words: capillary electrophoresis; short capillary;...

A presente tese descreve o aprimoramento do acoplamento de eletroforese capilar/espectrometria de massas com ionização por electrospray (CE-ESI-MS) (1) pelo desenvolvimento de estratégias de controle de temperatura e posicionamento e (2) pela inclusão de dois detectores condutométricos sem contato (C4Ds) ao capilar de separação eletroforética de modo a se obter informações complementares àquelas fornecidas pelo MS. Os primeiros aprimoramentos consistiram na introdução de uma plataforma móvel para o CE e um módulo de refrigeração da porção externa do capilar. Com estes aprimoramentos, foi possível realizar estudo de cinética de hidrólise de monoetilcarbonato (MEC) por CE-ESI-MS, obtendo-se, pela primeira vez, o valor da energia de ativação de 99 ± 8 kJ mol-1. Posteriormente, foi desenvolvida uma série de protótipos de cartuchos impressos 3D em ABS, permitindo a introdução de até dois C4Ds. Além da inclusão dos detectores, a versão aprimorada do cartucho permitiu um bom comportamento térmico da coluna, permitindo que, tal como em sistemas CE-DAD, correntes eletroforéticas alcancem valores da ordem de 100 µA sem efeitos térmicos indesejados (o que não ocorre ao se utilizar o cartucho original para CE-MS). As possibilidades do arranjo CE-(C4D)2-ESI-MS foram demonstradas pelo desenvolvimento de métodos analíticos de separação para: (1) açúcares a pH 11,2; (2) aminas biogênicas a pH 2,0 e (3) ácidos carboxílicos a pH 7,5. A compatibilização dos eletroferogramas dos C4Ds ao longo do capilar e do ESI-MS no final do capilar foi conseguida pela correção da escala de tempo. Assim, as informações obtidas com os vários detectores podiam ser facilmente complementadas. Devido à baixa seletividade intrínseca do C4D, este se mostra amplamente complementar ao ESI-MS, que é o sistema mais seletivo para CE disponível na atualidade. Embora este último também seja altamente sensível, o C4D se mostrou comparável ou até mais apropriado em alguns casos. Assim, esta combinação única apresenta um grande potencial como ferramenta analítica. / The capillary electrophoresis/mass spectrometry with electrospray source (CE-ESI-MS) was improved by (1) the development of new temperature control and positioning systems and (2) the inclusion of two capacitively coupled contactless conductivity detectors (C4Ds) to the electrophoretic separation capillary allowing to obtain complimentary information to the MS. The initial improvements were the introduction of a sliding platform for the CE equipment and a thermostatic module for the portion of the capillary outside the CE environment. These improvements allowed obtaining, for the first time, the activation energy of hydrolysis reaction of monoethyl carbonate: 99 ± 8 kJ mol-1. However, the most important improvement was the development of 3D-printed cartridge allowing the inclusion of up to two C4Ds along the capillary. This cartridge also allowed a significant improvement of the thermal control over the capillary. No significant difference of the original CE-DAD was observed for electrophoretic currents up to 100 µA. The original CE-MS has similar behavior only until 60 µA. New possibilities of the CE-(C4D)2-ESI-MS setup were demonstrated by the development of analytical methods for separation of: (1) sugars at pH 11.2, (2) biogenic amines at pH 2.0, and (3) carboxylic acids at pH 7.5. The electropherograms of the three detectors were made compatible by correcting the time scales. Therefore, the information obtained from the three detectors may be easily complemented. Thanks to the intrinsic low-selectivity of the C4D, that is complementary to the MS, which is the most selective detector for CE today. Although MS is also highly sensitive, C4D had similar or even better performance in some cases. Therefore, this unique combination is powerful analytical tool

A presente tese descreve o aprimoramento do acoplamento de eletroforese capilar/espectrometria de massas com ionização por electrospray (CE-ESI-MS) (1) pelo desenvolvimento de estratégias de controle de temperatura e posicionamento e (2) pela inclusão de dois detectores condutométricos sem contato (C4Ds) ao capilar de separação eletroforética de modo a se obter informações complementares àquelas fornecidas pelo MS. Os primeiros aprimoramentos consistiram na introdução de uma plataforma móvel para o CE e um módulo de refrigeração da porção externa do capilar. Com estes aprimoramentos, foi possível realizar estudo de cinética de hidrólise de monoetilcarbonato (MEC) por CE-ESI-MS, obtendo-se, pela primeira vez, o valor da energia de ativação de 99 ± 8 kJ mol-1. Posteriormente, foi desenvolvida uma série de protótipos de cartuchos impressos 3D em ABS, permitindo a introdução de até dois C4Ds. Além da inclusão dos detectores, a versão aprimorada do cartucho permitiu um bom comportamento térmico da coluna, permitindo que, tal como em sistemas CE-DAD, correntes eletroforéticas alcancem valores da ordem de 100 µA sem efeitos térmicos indesejados (o que não ocorre ao se utilizar o cartucho original para CE-MS). As possibilidades do arranjo CE-(C4D)2-ESI-MS foram demonstradas pelo desenvolvimento de métodos analíticos de separação para: (1) açúcares a pH 11,2; (2) aminas biogênicas a pH 2,0 e (3) ácidos carboxílicos a pH 7,5. A compatibilização dos eletroferogramas dos C4Ds ao longo do capilar e do ESI-MS no final do capilar foi conseguida pela correção da escala de tempo. Assim, as informações obtidas com os vários detectores podiam ser facilmente complementadas. Devido à baixa seletividade intrínseca do C4D, este se mostra amplamente complementar ao ESI-MS, que é o sistema mais seletivo para CE disponível na atualidade. Embora este último também seja altamente sensível, o C4D se mostrou comparável ou até mais apropriado em alguns casos. Assim, esta combinação única apresenta um grande potencial como ferramenta analítica. / The capillary electrophoresis/mass spectrometry with electrospray source (CE-ESI-MS) was improved by (1) the development of new temperature control and positioning systems and (2) the inclusion of two capacitively coupled contactless conductivity detectors (C4Ds) to the electrophoretic separation capillary allowing to obtain complimentary information to the MS. The initial improvements were the introduction of a sliding platform for the CE equipment and a thermostatic module for the portion of the capillary outside the CE environment. These improvements allowed obtaining, for the first time, the activation energy of hydrolysis reaction of monoethyl carbonate: 99 ± 8 kJ mol-1. However, the most important improvement was the development of 3D-printed cartridge allowing the inclusion of up to two C4Ds along the capillary. This cartridge also allowed a significant improvement of the thermal control over the capillary. No significant difference of the original CE-DAD was observed for electrophoretic currents up to 100 µA. The original CE-MS has similar behavior only until 60 µA. New possibilities of the CE-(C4D)2-ESI-MS setup were demonstrated by the development of analytical methods for separation of: (1) sugars at pH 11.2, (2) biogenic amines at pH 2.0, and (3) carboxylic acids at pH 7.5. The electropherograms of the three detectors were made compatible by correcting the time scales. Therefore, the information obtained from the three detectors may be easily complemented. Thanks to the intrinsic low-selectivity of the C4D, that is complementary to the MS, which is the most selective detector for CE today. Although MS is also highly sensitive, C4D had similar or even better performance in some cases. Therefore, this unique combination is powerful analytical tool