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The production of bio-ethanol from lignocellulosic material requires a more efficient process to be feasible and compete with products from fossil fuels. There is a need to rapidly and nondestructively be able to determine key components during fermentation. Raman spectroscopy is a technique, which can be used to monitor the fermentation process in real-time and provide information about key components which can be accessed immediately, thus facilitating process control. A continuous system with membrane cell recycling was set up and fermentations were performed using Saccharomyces cerevisiae ATCC 96581. Fermentations were performed to test for optimal dilution rates and operating times, the effect of different sugar concentrations in the media feed, and which position in the system was optimal for Raman data collection. Raman data and aliquot samples for HPLC validation were continuously collected throughout the fermentations. Raman data was analysed with PLS models to obtain component concentrations, for which RMSE was calculated in order to compare to HPLC validation set. Fermentations were performed with synthetic glucose media as well as with poplar hydrolysate. It was shown that the continuous system with membrane cell recycling could achieve a glucose-to-ethanol conversion of between 75-100%. The process could be sufficiently monitored by Raman spectroscopy, and predicted concentrations were within the range of the validation set in most cases. However, the error of prediction varied between the different fermentations.

Continuous fermentations were performed in an external-recycle, biofilm reactor using glucose and CO2 as carbon substrates. The nitrogen source for the auxotrophic Actinobacillus succinogenes was a combination of yeast extract (YE) and corn steep liquor (CSL), and sometimes only YE or CSL was used. In this study, the succinic acid productivity of A. succinogenes decreased by 67% as the amount of YE in the complex nitrogen source mixture decreased from 16 g·L-1 to 0 g·L-1. Succinic acid production increased as the CSL concentration in the nitrogen source increased, and the mass ratio of succinic acid to acetic acid exceeded the theoretical maximum limit of 3,93 g·g-1 when only CSL was used as the nitrogen source. The mass ratio of formic acid to acetic acid was consistently within the theoretical yield limitations (0,77 g·g−1) and decreased as the CSL concentration in the nitrogen source increased. The highest SA concentration in this study was 22,57 g·L-1 when only YE was used as the nitrogen source in the growth medium, and the highest SA productivity obtained in this study was 1,58 g·L-1·h-1 when a combination of YE and CSL was used as a nitrogen source. The highest mass ratio of SA to AA achieved was 8,3 g·g-1 when CSL was the sole nitrogen source. The mass ratio of FA to AA was consistently less than 0,77 g·g-1, approaching 0 g·g-1, as the CSL concentration in the nitrogen source increased. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2016. / National Research Foundation (NRF) / Chemical Engineering / MSc / Unrestricted

Solid substrate cultivation (SSC) using lignocellulosic non-food feedstock, such as switchgrass, is an alternative for advanced biofuel production. Acetone-Butanol-Ethanol (ABE) fermentation in two stages using a sequential culture of microorganisms from the class Clostridia is an approach proposed to increase the butanol production. The goal was to test the efficacy of a sequential culture on high solid substrate cultivation in batch and continuous cultivation, and to evaluate conditions to optimize butanol production using switchgrass as substrate. Initial batch experiments were used to determine particle size effect, choice of solvent producer and pretreatment evaluation: The effect of particle size on gas production was surface area-dependent, 2 mm particle size of switchgrass was better fermented by clostridia than the other particle sizes. C. thermocellum improved switchgrass fermentation by C. beijerinckii. Moreover, C. saccharoperbutylacetonicum produced the highest butanol yield on glucose as substrate. The Fenton reaction was studied as a potential pretreatment for switchgrass. C. beijerinckii grew better on Fenton-treated material, but solvent production was low. The major conclusion of the continuous flow on SSC experiment was that there is no statistical difference in the effect of flow rate within the flow range tested.

Actinobacillus succinogenes cells were grown on Poraver® support particles in a packed-bed reactor. Dilution rates (D) of 0.054–0.72 h-1 were investigated. Glucose was used as substrate. CO2 (g) was bubbled into a complex medium to satisfy the fixation requirements and maintain anaerobic conditions. At D ≥ 0.31 h-1, an initial glucose concentration of 35 g.L-1 was used; at lower dilution rates, this was increased to 60 g.L-1 in order to avoid substrate limitations. By-product formation included acetic and formic acids. A maximum productivity of 10.7 g.L-1 was obtained at D = 0.7 h-1. It was found that the system provided repeatable results at a given D. The longest steady state period was maintained for about 97 h at D = 0.31 h-1. Steady state stability was maintained for > 72 h at D < 0.31 h-1. For periods longer than 75 h, however, inhibitory acid titres resulted in a gradual decline in productivity. At higher dilution rates, long-term stability could not be maintained. The low acid titres produced significant biofilm sloughing following aggressive biofilm growth, resulting in oscillatory system behaviour. For fermentation times < 115 h, the dilution rate was secondary to the attachment area in determining the total biomass at steady state. Total biomass values were then used to determine specific rates. A clear trend was observed, with the specific glucose consumption rate, and specific acid production rates, increasing with increasing D. This was explained by assuming a maintenance-driven system at all Ds studied. A product analysis indicated that at ΔS < 15 g.L-1, pyruvate formate lyase was the preferred oxidative route. A shift to the pyruvate dehydrogenase pathway occurred at higher ΔS values, so that the highest YSS values obtained exceeded 0.85 g.g-1. A decrease in C3 by-product formation resulted in high YSS values being maintained, indicating an additional, unknown source of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). It is recommended that any process utilising immobilised A. succinogenes cells should operate at an intermediate D, in order to maintain long-term reactor stability, high productivities and good yields. / Dissertation (MEng)--University of Pretoria, 2013. / gm2014 / Chemical Engineering / unrestricted

Mediu-se a atividade invertásica de células intactas de levedura (S. cerevisiae) cultivadas por processo contínuo em meio preparado a partir de melaço de cana-de-açúcar, nas seguintes condições: a) aerobiose, com adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,10 e 0,24 &#934; (l/l.min): 1 e 2 N(min-1): 500 e 700 b) aerobiose, sem adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,11; 0,14 e 0,23 &#934; (l/l.min): 1 e 2 N(min-1): 500 c) anaerobiose, com e sem adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,24 N(min-1): 500 Nas condições referidas obtiveram-se cultivos contínuos em regime permanente e transiente. Realizou-se, também, cultivo descontínuo de células (mosto suplementado, &#934; = 2 l/l.min e N = 500 min-1), constatando-se que a atividade invertásica específica (v) variava no decorrer do processo. A análise dos resultados deste ensaio permitiu concluir que a variação de v poderia ser o resultado de um mecanismo de repressão-desrepressão controlado pela concentração de glicose no meio. Outrossim, o valor constante de v no final do processo refletiria o fato de que a enzima na realidade está imobilizada na parede celular. No caso dos cultivos contínuos foi observado que os valores de v, em função do tempo, oscilaram, sendo que o período de oscilação não foi maior que 10 min. Outrossim, deve ser destacado que o P.O.M da atividade invertásica guardou certa dependência com as condições operacionais usadas nos ensaios. Assim, no caso de cultivos em aerobiose com mosto não suplementado o P.O.M de v em regime permanente é menor do que em regime transiente. De outra parte, no caso de cultivos em aerobiose com mosto suplementado o P.O.M foi de mesma magnitude tanto em regime transiente como permanente. Através de balanços materiais adequados foi possível calcular as velocidades específicas de crescimento celular (&#181;), de consumo de AR (&#181;S) e de consumo de sacarose (&#181;S\'-S) em função do tempo. Em regime transiente não se encontrou nenhuma lei que correlacionasse estas velocidades específicas entre si. Contudo, nos casos em que foi empregado mosto acrescido de nutrientes, verificou-se graficamente que deve existir correlação entre &#181;S e &#181;(S\'-S), o que evidenciaria o acoplamento existente entre a decomposição da sacarose e o consumo de AR pelas células, intermediada pela invertase. Ressalte-se, também, que v e &#181;(S\'-S) não mostraram correlação aparente, o que é de se estranhar, pois nas condições de trabalho a hidrólise da sacarase só poderia se dar por via enzimática. Em regime transiente observou-se que a atividade invertásica específica apresentava alguma correlação com a velocidade de crescimento celular (&#181;X). Dependendo das condições do experimento v e &#181;X eram funções crescentes ou decrescentes com o tempo. Esta correlação ficou bem demonstrada nos cultivos em regime permanente, onde v- era função crescente de &#181;X, obedecendo à relação: v- = 0,54 + 10,66 &#181X (r = 0,94) Em regime permanente foi verificado, também, que: a) &#181;S e &#181;(S\'-S) para os cultivos em anaerobiose eram superiores àquelas dos cultivos em aerobiose, independente do fato do mosto ter sido ou não suplementado; b) v- diminuia, de acordo com as condições operacionais empregadas, na seguinte ordem: cultivo em aerobiose com mosto suplementado, cultivo em anaerobiose com ou sem mosto suplementado e cultivo em aerobiose e mosto não suplementado; c) o fator de conversão de substrato em microrganismo decresceu na seguinte ordem: cultivo em aerobiose e mosto suplementado, cultivo em aerobiose e mosto não suplementado e cultivo em anaerobiose com e sem mosto suplementado. A correlação existente entre v e &#181;X mostrou que os valores de v determinados referem-se à atividade global da invertase imobilizada na parede celular e não àquela parcela da atividade que gerou os açúcares redutores realmente consumidos pela célula. Além disso, do modo como foi feito o tratamento das amostras, é possível admitir que não ocorreram modificações significativas nas características morfo-fisiológicas das células, representando estas a população existente na dorna no momento da amostragem. Por conseguinte a oscilação de v poderia ser vista como sendo uma variação na interação da invertase com a sacarose, devido aos posicionamentos distintos que as moléculas da enzima teriam na parede celular durante as várias etapas do ciclo celular. / The invertase specific activities of intact yeast cells obtained from continuous cultures on sugar-cane molasse media were determined. The experiments were carried out under the following conditions: a) aerated and supplemented medium: D(h-1): 0,10 and 0,24 &#934; (l/l.min): 1 and 2 N(min-1): 500 and 700 b) aerated and non supplemented medium: D(h-1): 0,11; 0,14 and 0,23 &#934; (l/l.min): 1 and 2 N(min-1): 500 c) non aerated, supplemented and non supplemented medium: D(h-1): 0,24 N(min-1): 500 The above conditions lead to unsteady and to steady-state cultures. It was observed that the invertase specific activity (v) varied during a batch growth experiment carried out under the following conditions: supplemented molasses, &#934; = 2 l/l.min and N= 500 min-1. The observed variation was probably caused by a repression-desrepression phenomenon on the biosynthesis of invertase, controlled by glucose concentration in the medium. Nevertheless, v was approximately constant at the end of the process, which could be explained as a result of the enzyme immobilization on the cell wall. It was also observed that in continuous test v oscillated, and the oscillatory period was not greater than 10 min. Otherwise, it must be enhanced that there were some correlations between average oscillatory period and the experimental conditions. Considering the aerated continuous tests carried out with non supplemented medium, it was found that average oscillatory period in steady-state was lower than in unsteady-state. Nevertheless, in aerated continuous cultures carried out with supplemented medium average oscillatory period was the same, regardless if the system would be in unsteady ar steady-state. The following parameters were calculated: specific growth rate of the yeast (&#181;), specific consumption rate of reducing sugar (&#181;S) and specific hydrolysing rate of sucrose (&#181;S\'-S). Such parameters didn\'t show any correlation among them during unsteady states. Nevertheless, the curves &#181;S=f(t) and (&#181;S\'-S) = f(t), when supplemented molasses were used, show some correlation between &#181;S and (&#181;S\'-S), which could show a coupling between sucrose hydrolysis and reducing sugar consumption by cells, intermediated by invertase. In spite of the fact that only invertase could hydrolyse sucrose under the experimental conditions used, it wasn\'t possible to find any correlation between (&#181;S\'-S) and v. Otherwise, it was found a correlation between v and &#181;X (growth rate) during unsteady-state. Such correlation was well demonstrated in steady-state tests: v- - 0.54 + 10.66 &#181;X (r = 0.94) The other main features of the experimental results obtained in steady-state continuous experiments are: a) &#181;X and (&#181;S\'-S), for experiments carried out under anaerobic conditions, were higher than the same parameters for experiments carried out under aerobic conditions, regardless if the molasses had been supplemented or not; b) v- varied as follows: (aerated culture with supplemented medium) > (non aerated culture with or without supplemented medium) > (aerobic culture with non supplemented medium); c) the yield factor varied as follows: (aerated culture with supplemented medium) > (aerated culture with non supplemented medium) > (non-aerated culture with or without supplemented medium). The correlation between v and &#181;X was an evidence that the measured values of v represent the total invertase activity of the cell, and has no relation with the fraction of invertase that produced the reducing sugars assimilated by the cells. Otherwise, it seems possible to assure that the sample manipulatian did not affect the cell structure and that, cansequently, the measured enzyme activity represents the actual invertase activity af the growing cells. The oscillatory phenomena could then be considered as a variation of the invertase-sucrose interaction due to different positions of the invertase molecules on the cell wall during the cell growth.

A bactéria Zymomonas mobilis atraiu considerável interesse nas últimas décadas devido ao seu metabolismo único e eficientes características fermentativas na produção de etanol a partir de açúcares simples. No entanto, apesar das aparentes vantagens na conversão e taxas específicas quando comparada com as leveduras, estas ainda dominam o mercado produtivo de etanol. Dentre os diversos modelos encontrados na literatura para representar o processo fermentativo de glicose através de Z. mobilis, o modelo proposto por Jöbses et al. (1986) aparenta ser bem estruturado e ideal para a criação de estratégias de controle e otimização de processos fermentativos com este microrganismo, viabilizando sua utilização em escala industrial. Fermentações de Z. mobilis em regime contínuo apresentam comportamento oscilatório para baixas taxas de diluição, fenômeno este comprovado experimentalmente. Experimentos laboratoriais foram utilizados para a estimação de parâmetros do modelo de Jöbses, através da técnica de minimização da derivada do erro da função objetivo. O novo modelo ajustado apresenta dinâmica equivalente ao modelo original de Jöbses, fato este comprovado através da construção dos diagramas de bifurcação. Os diagramas de fase dos modelos apresentam algumas diferenças estruturais entre si, entretanto, a ocorrência de multiplicidade de estados estacionários em baixos valores de taxa de diluição está presente em todos. Em bioprocessos, a obtenção de informações sobre o sistema é um tanto complexa, devido a estes meios serem muito suscetíveis a distúrbios, contaminações, além de que medidas de concentrações são relativamente dispendiosas, associadas com um alto tempo morto, o que impossibilita, muitas vezes, a implementação de sistemas de controle eficientes. Para contribuir com a resolução deste problema foi desenvolvida uma nova inferência das variáveis de estado através da informação de consumo de hidróxido de sódio, utilizado no controle de pH do meio. Inferidores de variáveis de estado que utilizam a variação no consumo de hidróxido de sódio foram ajustados e apresentaram resultados promissores, mostrando a viabilidade do desenvolvimento de metodologias para este tipo de análise, tornando a caracterização de sistemas fermentativos mais rápida e acessível, não apenas em nível acadêmico, que a desenvolvida atualmente, principalmente devido ao baixo custo associado, e a dinâmica rápida deste tipo de sensor. / The bacterium Zymomonas mobilis has attracted considerable interest in recent decades due to their unique metabolism and efficient characteristics in the production of ethanol by simple sugars. However, despite the apparent advantages in the conversion and specific rates, when compared with yeast, there is no industrial-scale fermentations with these bacteria. Among the various models found in literature to represent glucose fermentation with Z. mobilis, the model proposed by Jöbses et al. (1986) appears to be well structured and ideal for the creation of control strategies and optimization methods for increase productions. Fermentation in continuous mode with this organism exhibit oscillatory behavior at low dilution rates, phenomenon showed or demonstrated by experiments performed on laboratory scale. A laboratorial experiment also was used for estimation of new parameters group of Jöbses models, using the technique of minimization of error derivative for objective function. The new adjusted model set presents dynamics similar to the original model, fact confirmed by bifurcation analyses of both models. The diagram for these models show structural differences, but both presents steady states multiplicity and Hopf bifurcations. The obtained of fermentation characteristics is very complex, due to these reactive means being very susceptible to disturbances, contamination, among others, and concentrations measures are relatively expensive and whit a high dead time associated, which often prevents the implementation of control tools. The proposed inference of state variables by consumption rate of hydroxide sodium, used for maintenance pH medium, was tested and confirmed. Virtual sensors using the information of consumption rate of hydroxide were adjusted and have shown promising results, demonstrating the feasibility of developing methods of analysis based on this methodology, making the characterization of fermentative systems faster and cheaper them currently developed, mainly due to low cost associated, and the dynamics of this fast type of sensor.

A bactéria Zymomonas mobilis atraiu considerável interesse nas últimas décadas devido ao seu metabolismo único e eficientes características fermentativas na produção de etanol a partir de açúcares simples. No entanto, apesar das aparentes vantagens na conversão e taxas específicas quando comparada com as leveduras, estas ainda dominam o mercado produtivo de etanol. Dentre os diversos modelos encontrados na literatura para representar o processo fermentativo de glicose através de Z. mobilis, o modelo proposto por Jöbses et al. (1986) aparenta ser bem estruturado e ideal para a criação de estratégias de controle e otimização de processos fermentativos com este microrganismo, viabilizando sua utilização em escala industrial. Fermentações de Z. mobilis em regime contínuo apresentam comportamento oscilatório para baixas taxas de diluição, fenômeno este comprovado experimentalmente. Experimentos laboratoriais foram utilizados para a estimação de parâmetros do modelo de Jöbses, através da técnica de minimização da derivada do erro da função objetivo. O novo modelo ajustado apresenta dinâmica equivalente ao modelo original de Jöbses, fato este comprovado através da construção dos diagramas de bifurcação. Os diagramas de fase dos modelos apresentam algumas diferenças estruturais entre si, entretanto, a ocorrência de multiplicidade de estados estacionários em baixos valores de taxa de diluição está presente em todos. Em bioprocessos, a obtenção de informações sobre o sistema é um tanto complexa, devido a estes meios serem muito suscetíveis a distúrbios, contaminações, além de que medidas de concentrações são relativamente dispendiosas, associadas com um alto tempo morto, o que impossibilita, muitas vezes, a implementação de sistemas de controle eficientes. Para contribuir com a resolução deste problema foi desenvolvida uma nova inferência das variáveis de estado através da informação de consumo de hidróxido de sódio, utilizado no controle de pH do meio. Inferidores de variáveis de estado que utilizam a variação no consumo de hidróxido de sódio foram ajustados e apresentaram resultados promissores, mostrando a viabilidade do desenvolvimento de metodologias para este tipo de análise, tornando a caracterização de sistemas fermentativos mais rápida e acessível, não apenas em nível acadêmico, que a desenvolvida atualmente, principalmente devido ao baixo custo associado, e a dinâmica rápida deste tipo de sensor. / The bacterium Zymomonas mobilis has attracted considerable interest in recent decades due to their unique metabolism and efficient characteristics in the production of ethanol by simple sugars. However, despite the apparent advantages in the conversion and specific rates, when compared with yeast, there is no industrial-scale fermentations with these bacteria. Among the various models found in literature to represent glucose fermentation with Z. mobilis, the model proposed by Jöbses et al. (1986) appears to be well structured and ideal for the creation of control strategies and optimization methods for increase productions. Fermentation in continuous mode with this organism exhibit oscillatory behavior at low dilution rates, phenomenon showed or demonstrated by experiments performed on laboratory scale. A laboratorial experiment also was used for estimation of new parameters group of Jöbses models, using the technique of minimization of error derivative for objective function. The new adjusted model set presents dynamics similar to the original model, fact confirmed by bifurcation analyses of both models. The diagram for these models show structural differences, but both presents steady states multiplicity and Hopf bifurcations. The obtained of fermentation characteristics is very complex, due to these reactive means being very susceptible to disturbances, contamination, among others, and concentrations measures are relatively expensive and whit a high dead time associated, which often prevents the implementation of control tools. The proposed inference of state variables by consumption rate of hydroxide sodium, used for maintenance pH medium, was tested and confirmed. Virtual sensors using the information of consumption rate of hydroxide were adjusted and have shown promising results, demonstrating the feasibility of developing methods of analysis based on this methodology, making the characterization of fermentative systems faster and cheaper them currently developed, mainly due to low cost associated, and the dynamics of this fast type of sensor.

A bactéria Zymomonas mobilis atraiu considerável interesse nas últimas décadas devido ao seu metabolismo único e eficientes características fermentativas na produção de etanol a partir de açúcares simples. No entanto, apesar das aparentes vantagens na conversão e taxas específicas quando comparada com as leveduras, estas ainda dominam o mercado produtivo de etanol. Dentre os diversos modelos encontrados na literatura para representar o processo fermentativo de glicose através de Z. mobilis, o modelo proposto por Jöbses et al. (1986) aparenta ser bem estruturado e ideal para a criação de estratégias de controle e otimização de processos fermentativos com este microrganismo, viabilizando sua utilização em escala industrial. Fermentações de Z. mobilis em regime contínuo apresentam comportamento oscilatório para baixas taxas de diluição, fenômeno este comprovado experimentalmente. Experimentos laboratoriais foram utilizados para a estimação de parâmetros do modelo de Jöbses, através da técnica de minimização da derivada do erro da função objetivo. O novo modelo ajustado apresenta dinâmica equivalente ao modelo original de Jöbses, fato este comprovado através da construção dos diagramas de bifurcação. Os diagramas de fase dos modelos apresentam algumas diferenças estruturais entre si, entretanto, a ocorrência de multiplicidade de estados estacionários em baixos valores de taxa de diluição está presente em todos. Em bioprocessos, a obtenção de informações sobre o sistema é um tanto complexa, devido a estes meios serem muito suscetíveis a distúrbios, contaminações, além de que medidas de concentrações são relativamente dispendiosas, associadas com um alto tempo morto, o que impossibilita, muitas vezes, a implementação de sistemas de controle eficientes. Para contribuir com a resolução deste problema foi desenvolvida uma nova inferência das variáveis de estado através da informação de consumo de hidróxido de sódio, utilizado no controle de pH do meio. Inferidores de variáveis de estado que utilizam a variação no consumo de hidróxido de sódio foram ajustados e apresentaram resultados promissores, mostrando a viabilidade do desenvolvimento de metodologias para este tipo de análise, tornando a caracterização de sistemas fermentativos mais rápida e acessível, não apenas em nível acadêmico, que a desenvolvida atualmente, principalmente devido ao baixo custo associado, e a dinâmica rápida deste tipo de sensor. / The bacterium Zymomonas mobilis has attracted considerable interest in recent decades due to their unique metabolism and efficient characteristics in the production of ethanol by simple sugars. However, despite the apparent advantages in the conversion and specific rates, when compared with yeast, there is no industrial-scale fermentations with these bacteria. Among the various models found in literature to represent glucose fermentation with Z. mobilis, the model proposed by Jöbses et al. (1986) appears to be well structured and ideal for the creation of control strategies and optimization methods for increase productions. Fermentation in continuous mode with this organism exhibit oscillatory behavior at low dilution rates, phenomenon showed or demonstrated by experiments performed on laboratory scale. A laboratorial experiment also was used for estimation of new parameters group of Jöbses models, using the technique of minimization of error derivative for objective function. The new adjusted model set presents dynamics similar to the original model, fact confirmed by bifurcation analyses of both models. The diagram for these models show structural differences, but both presents steady states multiplicity and Hopf bifurcations. The obtained of fermentation characteristics is very complex, due to these reactive means being very susceptible to disturbances, contamination, among others, and concentrations measures are relatively expensive and whit a high dead time associated, which often prevents the implementation of control tools. The proposed inference of state variables by consumption rate of hydroxide sodium, used for maintenance pH medium, was tested and confirmed. Virtual sensors using the information of consumption rate of hydroxide were adjusted and have shown promising results, demonstrating the feasibility of developing methods of analysis based on this methodology, making the characterization of fermentative systems faster and cheaper them currently developed, mainly due to low cost associated, and the dynamics of this fast type of sensor.

Mediu-se a atividade invertásica de células intactas de levedura (S. cerevisiae) cultivadas por processo contínuo em meio preparado a partir de melaço de cana-de-açúcar, nas seguintes condições: a) aerobiose, com adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,10 e 0,24 &#934; (l/l.min): 1 e 2 N(min-1): 500 e 700 b) aerobiose, sem adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,11; 0,14 e 0,23 &#934; (l/l.min): 1 e 2 N(min-1): 500 c) anaerobiose, com e sem adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,24 N(min-1): 500 Nas condições referidas obtiveram-se cultivos contínuos em regime permanente e transiente. Realizou-se, também, cultivo descontínuo de células (mosto suplementado, &#934; = 2 l/l.min e N = 500 min-1), constatando-se que a atividade invertásica específica (v) variava no decorrer do processo. A análise dos resultados deste ensaio permitiu concluir que a variação de v poderia ser o resultado de um mecanismo de repressão-desrepressão controlado pela concentração de glicose no meio. Outrossim, o valor constante de v no final do processo refletiria o fato de que a enzima na realidade está imobilizada na parede celular. No caso dos cultivos contínuos foi observado que os valores de v, em função do tempo, oscilaram, sendo que o período de oscilação não foi maior que 10 min. Outrossim, deve ser destacado que o P.O.M da atividade invertásica guardou certa dependência com as condições operacionais usadas nos ensaios. Assim, no caso de cultivos em aerobiose com mosto não suplementado o P.O.M de v em regime permanente é menor do que em regime transiente. De outra parte, no caso de cultivos em aerobiose com mosto suplementado o P.O.M foi de mesma magnitude tanto em regime transiente como permanente. Através de balanços materiais adequados foi possível calcular as velocidades específicas de crescimento celular (&#181;), de consumo de AR (&#181;S) e de consumo de sacarose (&#181;S\'-S) em função do tempo. Em regime transiente não se encontrou nenhuma lei que correlacionasse estas velocidades específicas entre si. Contudo, nos casos em que foi empregado mosto acrescido de nutrientes, verificou-se graficamente que deve existir correlação entre &#181;S e &#181;(S\'-S), o que evidenciaria o acoplamento existente entre a decomposição da sacarose e o consumo de AR pelas células, intermediada pela invertase. Ressalte-se, também, que v e &#181;(S\'-S) não mostraram correlação aparente, o que é de se estranhar, pois nas condições de trabalho a hidrólise da sacarase só poderia se dar por via enzimática. Em regime transiente observou-se que a atividade invertásica específica apresentava alguma correlação com a velocidade de crescimento celular (&#181;X). Dependendo das condições do experimento v e &#181;X eram funções crescentes ou decrescentes com o tempo. Esta correlação ficou bem demonstrada nos cultivos em regime permanente, onde v- era função crescente de &#181;X, obedecendo à relação: v- = 0,54 + 10,66 &#181X (r = 0,94) Em regime permanente foi verificado, também, que: a) &#181;S e &#181;(S\'-S) para os cultivos em anaerobiose eram superiores àquelas dos cultivos em aerobiose, independente do fato do mosto ter sido ou não suplementado; b) v- diminuia, de acordo com as condições operacionais empregadas, na seguinte ordem: cultivo em aerobiose com mosto suplementado, cultivo em anaerobiose com ou sem mosto suplementado e cultivo em aerobiose e mosto não suplementado; c) o fator de conversão de substrato em microrganismo decresceu na seguinte ordem: cultivo em aerobiose e mosto suplementado, cultivo em aerobiose e mosto não suplementado e cultivo em anaerobiose com e sem mosto suplementado. A correlação existente entre v e &#181;X mostrou que os valores de v determinados referem-se à atividade global da invertase imobilizada na parede celular e não àquela parcela da atividade que gerou os açúcares redutores realmente consumidos pela célula. Além disso, do modo como foi feito o tratamento das amostras, é possível admitir que não ocorreram modificações significativas nas características morfo-fisiológicas das células, representando estas a população existente na dorna no momento da amostragem. Por conseguinte a oscilação de v poderia ser vista como sendo uma variação na interação da invertase com a sacarose, devido aos posicionamentos distintos que as moléculas da enzima teriam na parede celular durante as várias etapas do ciclo celular. / The invertase specific activities of intact yeast cells obtained from continuous cultures on sugar-cane molasse media were determined. The experiments were carried out under the following conditions: a) aerated and supplemented medium: D(h-1): 0,10 and 0,24 &#934; (l/l.min): 1 and 2 N(min-1): 500 and 700 b) aerated and non supplemented medium: D(h-1): 0,11; 0,14 and 0,23 &#934; (l/l.min): 1 and 2 N(min-1): 500 c) non aerated, supplemented and non supplemented medium: D(h-1): 0,24 N(min-1): 500 The above conditions lead to unsteady and to steady-state cultures. It was observed that the invertase specific activity (v) varied during a batch growth experiment carried out under the following conditions: supplemented molasses, &#934; = 2 l/l.min and N= 500 min-1. The observed variation was probably caused by a repression-desrepression phenomenon on the biosynthesis of invertase, controlled by glucose concentration in the medium. Nevertheless, v was approximately constant at the end of the process, which could be explained as a result of the enzyme immobilization on the cell wall. It was also observed that in continuous test v oscillated, and the oscillatory period was not greater than 10 min. Otherwise, it must be enhanced that there were some correlations between average oscillatory period and the experimental conditions. Considering the aerated continuous tests carried out with non supplemented medium, it was found that average oscillatory period in steady-state was lower than in unsteady-state. Nevertheless, in aerated continuous cultures carried out with supplemented medium average oscillatory period was the same, regardless if the system would be in unsteady ar steady-state. The following parameters were calculated: specific growth rate of the yeast (&#181;), specific consumption rate of reducing sugar (&#181;S) and specific hydrolysing rate of sucrose (&#181;S\'-S). Such parameters didn\'t show any correlation among them during unsteady states. Nevertheless, the curves &#181;S=f(t) and (&#181;S\'-S) = f(t), when supplemented molasses were used, show some correlation between &#181;S and (&#181;S\'-S), which could show a coupling between sucrose hydrolysis and reducing sugar consumption by cells, intermediated by invertase. In spite of the fact that only invertase could hydrolyse sucrose under the experimental conditions used, it wasn\'t possible to find any correlation between (&#181;S\'-S) and v. Otherwise, it was found a correlation between v and &#181;X (growth rate) during unsteady-state. Such correlation was well demonstrated in steady-state tests: v- - 0.54 + 10.66 &#181;X (r = 0.94) The other main features of the experimental results obtained in steady-state continuous experiments are: a) &#181;X and (&#181;S\'-S), for experiments carried out under anaerobic conditions, were higher than the same parameters for experiments carried out under aerobic conditions, regardless if the molasses had been supplemented or not; b) v- varied as follows: (aerated culture with supplemented medium) > (non aerated culture with or without supplemented medium) > (aerobic culture with non supplemented medium); c) the yield factor varied as follows: (aerated culture with supplemented medium) > (aerated culture with non supplemented medium) > (non-aerated culture with or without supplemented medium). The correlation between v and &#181;X was an evidence that the measured values of v represent the total invertase activity of the cell, and has no relation with the fraction of invertase that produced the reducing sugars assimilated by the cells. Otherwise, it seems possible to assure that the sample manipulatian did not affect the cell structure and that, cansequently, the measured enzyme activity represents the actual invertase activity af the growing cells. The oscillatory phenomena could then be considered as a variation of the invertase-sucrose interaction due to different positions of the invertase molecules on the cell wall during the cell growth.