O presente trabalho teve por objetivo avaliar o perfil metabólico da utilização dos açúcares por diferentes leveduras (BG-1, CAT-1, FLEISCHMANN, PE-2, 1403-7A e LCM001) em diferentes meios de crescimento e também analisar o comportamento e a atividade de invertase destas leveduras durante um processo fermentativo com reciclos de células, semelhantemente ao processo industrial, levando em consideração os parâmetros: produção de etanol, formação de biomassa, produção de trealose, glicogênio, glicerol, rendimento e eficiência fermentativa. Os experimentos foram divididos em três partes: a 1a foi a quantificação da atividade de invertase das diferentes leveduras, em mosto de fermentação à base de mel e água (13% ART), a 2a analisouse o perfil de metabolização em diferentes meios de crescimento à base de YEP com 2% de açúcares (glicose, sacarose, ou glicose + sacarose), e a 3a foi a realização de uma fermentação alcoólica com 4 reciclos de células, com mosto de mel (13% ART), sendo os três primeiros utilizados para a avaliação do rendimento fermentativo, bem como seus indicadores (trealose, glicogênio, viabilidade, entre outros) e o último, destinado ao perfil de metabolização de açúcares em condições de fermentação. Os resultados mostram que as leveduras possuem diferentes atividades de invertase (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomassa; 1403-7A e LCM001, não possuem atividade), apresentam diferentes velocidades de hidrólise da sacarose, tanto em meios de crescimento como mostos (BG-1 e FLEISCHMANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h e LCM001 = >24 h), assim como a velocidade de metabolização dos açúcares presentes nestes. Conclui-se que a atividade de invertase é dependente da linhagem de levedura, assim como a velocidade de metabolização dos açúcares em meios de crescimento e mosto. A análise do perfil de metabolização de açúcares não permite identificar a presença de transportador de sacarose. No geral, as leveduras selecionadas apresentam melhor desempenho fermentativo. Por outro lado, verificou-se que as linhagens com transportador de sacarose apesar da menor produção de álcool, apresentaram uma boa eficiência fermentativa. O maior problema por parte destas últimas, é o alto tempo de fermentação e a baixa taxa de multiplicação, com conseqüente queda na viabilidade celular. / The aim of this work was to evaluate the metabolic profile in the utilization of sugars, using different yeast strains (BG-1, CAT-1, FLEISHMANN, PE-2, 1403-7A and LCM001) with different growth medium and also to analyze behavior and the invertase activities of these yeast strains during fermentative process with recycling, similar to the industrial process. The following parameters were used: ethanol production, biomass formation, trealose production, glycogen, glycerol, ethanol yield and fermentation efficiency. The trials were divided into three parts: First was activity quantification of invertase using different yeast strains, with a mix of molasses and water (13% ART), the second was analyzed the metabolization profile with different growth medium using YEP added 2% of sugars (glucose, sucrose, or glucose + sucrose), and the third it was the alcoholic fermentation with 4 yeast cell recycles, using wort of molasses and juice ( 13 % ART), The first three were utilized to evaluate the fermentation yield and also theirs indicatives (trealose, glycogen, viability within others) and, the last one was performed to study the profile of sugars metabolization in fermentation conditions. The results showed that those yeasts produced different invertase activities (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomass; 1403-7A and LCM001 did not have invertase activity), different velocity of sucrose hydrolysis, as much as medium growth as worts (BG-1 and FLEISCHANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h and LCM001 = >24 h), also as the velocity of sugars metabolization present on this medium. It can be concluded that the invertase activity is dependent of yeast strain, as the velocity of sugars metabolization in growth medium and wort. The profile analysis of metabolization of sugars did not allow to identify the presence of sucrose transporter. In general, the selected yeasts present the best fermentation performance. On the other hand, it was observed the strains with sucrose transportation did not show stress. The major problem of these yeasts were the high fermentation time and low propagation rate, and a decrease of the viability.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o perfil metabólico da utilização dos açúcares por diferentes leveduras (BG-1, CAT-1, FLEISCHMANN, PE-2, 1403-7A e LCM001) em diferentes meios de crescimento e também analisar o comportamento e a atividade de invertase destas leveduras durante um processo fermentativo com reciclos de células, semelhantemente ao processo industrial, levando em consideração os parâmetros: produção de etanol, formação de biomassa, produção de trealose, glicogênio, glicerol, rendimento e eficiência fermentativa. Os experimentos foram divididos em três partes: a 1a foi a quantificação da atividade de invertase das diferentes leveduras, em mosto de fermentação à base de mel e água (13% ART), a 2a analisouse o perfil de metabolização em diferentes meios de crescimento à base de YEP com 2% de açúcares (glicose, sacarose, ou glicose + sacarose), e a 3a foi a realização de uma fermentação alcoólica com 4 reciclos de células, com mosto de mel (13% ART), sendo os três primeiros utilizados para a avaliação do rendimento fermentativo, bem como seus indicadores (trealose, glicogênio, viabilidade, entre outros) e o último, destinado ao perfil de metabolização de açúcares em condições de fermentação. Os resultados mostram que as leveduras possuem diferentes atividades de invertase (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomassa; 1403-7A e LCM001, não possuem atividade), apresentam diferentes velocidades de hidrólise da sacarose, tanto em meios de crescimento como mostos (BG-1 e FLEISCHMANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h e LCM001 = >24 h), assim como a velocidade de metabolização dos açúcares presentes nestes. Conclui-se que a atividade de invertase é dependente da linhagem de levedura, assim como a velocidade de metabolização dos açúcares em meios de crescimento e mosto. A análise do perfil de metabolização de açúcares não permite identificar a presença de transportador de sacarose. No geral, as leveduras selecionadas apresentam melhor desempenho fermentativo. Por outro lado, verificou-se que as linhagens com transportador de sacarose apesar da menor produção de álcool, apresentaram uma boa eficiência fermentativa. O maior problema por parte destas últimas, é o alto tempo de fermentação e a baixa taxa de multiplicação, com conseqüente queda na viabilidade celular. / The aim of this work was to evaluate the metabolic profile in the utilization of sugars, using different yeast strains (BG-1, CAT-1, FLEISHMANN, PE-2, 1403-7A and LCM001) with different growth medium and also to analyze behavior and the invertase activities of these yeast strains during fermentative process with recycling, similar to the industrial process. The following parameters were used: ethanol production, biomass formation, trealose production, glycogen, glycerol, ethanol yield and fermentation efficiency. The trials were divided into three parts: First was activity quantification of invertase using different yeast strains, with a mix of molasses and water (13% ART), the second was analyzed the metabolization profile with different growth medium using YEP added 2% of sugars (glucose, sucrose, or glucose + sucrose), and the third it was the alcoholic fermentation with 4 yeast cell recycles, using wort of molasses and juice ( 13 % ART), The first three were utilized to evaluate the fermentation yield and also theirs indicatives (trealose, glycogen, viability within others) and, the last one was performed to study the profile of sugars metabolization in fermentation conditions. The results showed that those yeasts produced different invertase activities (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomass; 1403-7A and LCM001 did not have invertase activity), different velocity of sucrose hydrolysis, as much as medium growth as worts (BG-1 and FLEISCHANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h and LCM001 = >24 h), also as the velocity of sugars metabolization present on this medium. It can be concluded that the invertase activity is dependent of yeast strain, as the velocity of sugars metabolization in growth medium and wort. The profile analysis of metabolization of sugars did not allow to identify the presence of sucrose transporter. In general, the selected yeasts present the best fermentation performance. On the other hand, it was observed the strains with sucrose transportation did not show stress. The major problem of these yeasts were the high fermentation time and low propagation rate, and a decrease of the viability.

Mediu-se a atividade invertásica de células intactas de levedura (S. cerevisiae) cultivadas por processo contínuo em meio preparado a partir de melaço de cana-de-açúcar, nas seguintes condições: a) aerobiose, com adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,10 e 0,24 Φ (l/l.min): 1 e 2 N(min-1): 500 e 700 b) aerobiose, sem adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,11; 0,14 e 0,23 Φ (l/l.min): 1 e 2 N(min-1): 500 c) anaerobiose, com e sem adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,24 N(min-1): 500 Nas condições referidas obtiveram-se cultivos contínuos em regime permanente e transiente. Realizou-se, também, cultivo descontínuo de células (mosto suplementado, Φ = 2 l/l.min e N = 500 min-1), constatando-se que a atividade invertásica específica (v) variava no decorrer do processo. A análise dos resultados deste ensaio permitiu concluir que a variação de v poderia ser o resultado de um mecanismo de repressão-desrepressão controlado pela concentração de glicose no meio. Outrossim, o valor constante de v no final do processo refletiria o fato de que a enzima na realidade está imobilizada na parede celular. No caso dos cultivos contínuos foi observado que os valores de v, em função do tempo, oscilaram, sendo que o período de oscilação não foi maior que 10 min. Outrossim, deve ser destacado que o P.O.M da atividade invertásica guardou certa dependência com as condições operacionais usadas nos ensaios. Assim, no caso de cultivos em aerobiose com mosto não suplementado o P.O.M de v em regime permanente é menor do que em regime transiente. De outra parte, no caso de cultivos em aerobiose com mosto suplementado o P.O.M foi de mesma magnitude tanto em regime transiente como permanente. Através de balanços materiais adequados foi possível calcular as velocidades específicas de crescimento celular (µ), de consumo de AR (µS) e de consumo de sacarose (µS\'-S) em função do tempo. Em regime transiente não se encontrou nenhuma lei que correlacionasse estas velocidades específicas entre si. Contudo, nos casos em que foi empregado mosto acrescido de nutrientes, verificou-se graficamente que deve existir correlação entre µS e µ(S\'-S), o que evidenciaria o acoplamento existente entre a decomposição da sacarose e o consumo de AR pelas células, intermediada pela invertase. Ressalte-se, também, que v e µ(S\'-S) não mostraram correlação aparente, o que é de se estranhar, pois nas condições de trabalho a hidrólise da sacarase só poderia se dar por via enzimática. Em regime transiente observou-se que a atividade invertásica específica apresentava alguma correlação com a velocidade de crescimento celular (µX). Dependendo das condições do experimento v e µX eram funções crescentes ou decrescentes com o tempo. Esta correlação ficou bem demonstrada nos cultivos em regime permanente, onde v- era função crescente de µX, obedecendo à relação: v- = 0,54 + 10,66 &#181X (r = 0,94) Em regime permanente foi verificado, também, que: a) µS e µ(S\'-S) para os cultivos em anaerobiose eram superiores àquelas dos cultivos em aerobiose, independente do fato do mosto ter sido ou não suplementado; b) v- diminuia, de acordo com as condições operacionais empregadas, na seguinte ordem: cultivo em aerobiose com mosto suplementado, cultivo em anaerobiose com ou sem mosto suplementado e cultivo em aerobiose e mosto não suplementado; c) o fator de conversão de substrato em microrganismo decresceu na seguinte ordem: cultivo em aerobiose e mosto suplementado, cultivo em aerobiose e mosto não suplementado e cultivo em anaerobiose com e sem mosto suplementado. A correlação existente entre v e µX mostrou que os valores de v determinados referem-se à atividade global da invertase imobilizada na parede celular e não àquela parcela da atividade que gerou os açúcares redutores realmente consumidos pela célula. Além disso, do modo como foi feito o tratamento das amostras, é possível admitir que não ocorreram modificações significativas nas características morfo-fisiológicas das células, representando estas a população existente na dorna no momento da amostragem. Por conseguinte a oscilação de v poderia ser vista como sendo uma variação na interação da invertase com a sacarose, devido aos posicionamentos distintos que as moléculas da enzima teriam na parede celular durante as várias etapas do ciclo celular. / The invertase specific activities of intact yeast cells obtained from continuous cultures on sugar-cane molasse media were determined. The experiments were carried out under the following conditions: a) aerated and supplemented medium: D(h-1): 0,10 and 0,24 Φ (l/l.min): 1 and 2 N(min-1): 500 and 700 b) aerated and non supplemented medium: D(h-1): 0,11; 0,14 and 0,23 Φ (l/l.min): 1 and 2 N(min-1): 500 c) non aerated, supplemented and non supplemented medium: D(h-1): 0,24 N(min-1): 500 The above conditions lead to unsteady and to steady-state cultures. It was observed that the invertase specific activity (v) varied during a batch growth experiment carried out under the following conditions: supplemented molasses, Φ = 2 l/l.min and N= 500 min-1. The observed variation was probably caused by a repression-desrepression phenomenon on the biosynthesis of invertase, controlled by glucose concentration in the medium. Nevertheless, v was approximately constant at the end of the process, which could be explained as a result of the enzyme immobilization on the cell wall. It was also observed that in continuous test v oscillated, and the oscillatory period was not greater than 10 min. Otherwise, it must be enhanced that there were some correlations between average oscillatory period and the experimental conditions. Considering the aerated continuous tests carried out with non supplemented medium, it was found that average oscillatory period in steady-state was lower than in unsteady-state. Nevertheless, in aerated continuous cultures carried out with supplemented medium average oscillatory period was the same, regardless if the system would be in unsteady ar steady-state. The following parameters were calculated: specific growth rate of the yeast (µ), specific consumption rate of reducing sugar (µS) and specific hydrolysing rate of sucrose (µS\'-S). Such parameters didn\'t show any correlation among them during unsteady states. Nevertheless, the curves µS=f(t) and (µS\'-S) = f(t), when supplemented molasses were used, show some correlation between µS and (µS\'-S), which could show a coupling between sucrose hydrolysis and reducing sugar consumption by cells, intermediated by invertase. In spite of the fact that only invertase could hydrolyse sucrose under the experimental conditions used, it wasn\'t possible to find any correlation between (µS\'-S) and v. Otherwise, it was found a correlation between v and µX (growth rate) during unsteady-state. Such correlation was well demonstrated in steady-state tests: v- - 0.54 + 10.66 µX (r = 0.94) The other main features of the experimental results obtained in steady-state continuous experiments are: a) µX and (µS\'-S), for experiments carried out under anaerobic conditions, were higher than the same parameters for experiments carried out under aerobic conditions, regardless if the molasses had been supplemented or not; b) v- varied as follows: (aerated culture with supplemented medium) > (non aerated culture with or without supplemented medium) > (aerobic culture with non supplemented medium); c) the yield factor varied as follows: (aerated culture with supplemented medium) > (aerated culture with non supplemented medium) > (non-aerated culture with or without supplemented medium). The correlation between v and µX was an evidence that the measured values of v represent the total invertase activity of the cell, and has no relation with the fraction of invertase that produced the reducing sugars assimilated by the cells. Otherwise, it seems possible to assure that the sample manipulatian did not affect the cell structure and that, cansequently, the measured enzyme activity represents the actual invertase activity af the growing cells. The oscillatory phenomena could then be considered as a variation of the invertase-sucrose interaction due to different positions of the invertase molecules on the cell wall during the cell growth.

Mediu-se a atividade invertásica de células intactas de levedura (S. cerevisiae) cultivadas por processo contínuo em meio preparado a partir de melaço de cana-de-açúcar, nas seguintes condições: a) aerobiose, com adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,10 e 0,24 Φ (l/l.min): 1 e 2 N(min-1): 500 e 700 b) aerobiose, sem adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,11; 0,14 e 0,23 Φ (l/l.min): 1 e 2 N(min-1): 500 c) anaerobiose, com e sem adição de nutrientes ao meio D(h-1): 0,24 N(min-1): 500 Nas condições referidas obtiveram-se cultivos contínuos em regime permanente e transiente. Realizou-se, também, cultivo descontínuo de células (mosto suplementado, Φ = 2 l/l.min e N = 500 min-1), constatando-se que a atividade invertásica específica (v) variava no decorrer do processo. A análise dos resultados deste ensaio permitiu concluir que a variação de v poderia ser o resultado de um mecanismo de repressão-desrepressão controlado pela concentração de glicose no meio. Outrossim, o valor constante de v no final do processo refletiria o fato de que a enzima na realidade está imobilizada na parede celular. No caso dos cultivos contínuos foi observado que os valores de v, em função do tempo, oscilaram, sendo que o período de oscilação não foi maior que 10 min. Outrossim, deve ser destacado que o P.O.M da atividade invertásica guardou certa dependência com as condições operacionais usadas nos ensaios. Assim, no caso de cultivos em aerobiose com mosto não suplementado o P.O.M de v em regime permanente é menor do que em regime transiente. De outra parte, no caso de cultivos em aerobiose com mosto suplementado o P.O.M foi de mesma magnitude tanto em regime transiente como permanente. Através de balanços materiais adequados foi possível calcular as velocidades específicas de crescimento celular (µ), de consumo de AR (µS) e de consumo de sacarose (µS\'-S) em função do tempo. Em regime transiente não se encontrou nenhuma lei que correlacionasse estas velocidades específicas entre si. Contudo, nos casos em que foi empregado mosto acrescido de nutrientes, verificou-se graficamente que deve existir correlação entre µS e µ(S\'-S), o que evidenciaria o acoplamento existente entre a decomposição da sacarose e o consumo de AR pelas células, intermediada pela invertase. Ressalte-se, também, que v e µ(S\'-S) não mostraram correlação aparente, o que é de se estranhar, pois nas condições de trabalho a hidrólise da sacarase só poderia se dar por via enzimática. Em regime transiente observou-se que a atividade invertásica específica apresentava alguma correlação com a velocidade de crescimento celular (µX). Dependendo das condições do experimento v e µX eram funções crescentes ou decrescentes com o tempo. Esta correlação ficou bem demonstrada nos cultivos em regime permanente, onde v- era função crescente de µX, obedecendo à relação: v- = 0,54 + 10,66 &#181X (r = 0,94) Em regime permanente foi verificado, também, que: a) µS e µ(S\'-S) para os cultivos em anaerobiose eram superiores àquelas dos cultivos em aerobiose, independente do fato do mosto ter sido ou não suplementado; b) v- diminuia, de acordo com as condições operacionais empregadas, na seguinte ordem: cultivo em aerobiose com mosto suplementado, cultivo em anaerobiose com ou sem mosto suplementado e cultivo em aerobiose e mosto não suplementado; c) o fator de conversão de substrato em microrganismo decresceu na seguinte ordem: cultivo em aerobiose e mosto suplementado, cultivo em aerobiose e mosto não suplementado e cultivo em anaerobiose com e sem mosto suplementado. A correlação existente entre v e µX mostrou que os valores de v determinados referem-se à atividade global da invertase imobilizada na parede celular e não àquela parcela da atividade que gerou os açúcares redutores realmente consumidos pela célula. Além disso, do modo como foi feito o tratamento das amostras, é possível admitir que não ocorreram modificações significativas nas características morfo-fisiológicas das células, representando estas a população existente na dorna no momento da amostragem. Por conseguinte a oscilação de v poderia ser vista como sendo uma variação na interação da invertase com a sacarose, devido aos posicionamentos distintos que as moléculas da enzima teriam na parede celular durante as várias etapas do ciclo celular. / The invertase specific activities of intact yeast cells obtained from continuous cultures on sugar-cane molasse media were determined. The experiments were carried out under the following conditions: a) aerated and supplemented medium: D(h-1): 0,10 and 0,24 Φ (l/l.min): 1 and 2 N(min-1): 500 and 700 b) aerated and non supplemented medium: D(h-1): 0,11; 0,14 and 0,23 Φ (l/l.min): 1 and 2 N(min-1): 500 c) non aerated, supplemented and non supplemented medium: D(h-1): 0,24 N(min-1): 500 The above conditions lead to unsteady and to steady-state cultures. It was observed that the invertase specific activity (v) varied during a batch growth experiment carried out under the following conditions: supplemented molasses, Φ = 2 l/l.min and N= 500 min-1. The observed variation was probably caused by a repression-desrepression phenomenon on the biosynthesis of invertase, controlled by glucose concentration in the medium. Nevertheless, v was approximately constant at the end of the process, which could be explained as a result of the enzyme immobilization on the cell wall. It was also observed that in continuous test v oscillated, and the oscillatory period was not greater than 10 min. Otherwise, it must be enhanced that there were some correlations between average oscillatory period and the experimental conditions. Considering the aerated continuous tests carried out with non supplemented medium, it was found that average oscillatory period in steady-state was lower than in unsteady-state. Nevertheless, in aerated continuous cultures carried out with supplemented medium average oscillatory period was the same, regardless if the system would be in unsteady ar steady-state. The following parameters were calculated: specific growth rate of the yeast (µ), specific consumption rate of reducing sugar (µS) and specific hydrolysing rate of sucrose (µS\'-S). Such parameters didn\'t show any correlation among them during unsteady states. Nevertheless, the curves µS=f(t) and (µS\'-S) = f(t), when supplemented molasses were used, show some correlation between µS and (µS\'-S), which could show a coupling between sucrose hydrolysis and reducing sugar consumption by cells, intermediated by invertase. In spite of the fact that only invertase could hydrolyse sucrose under the experimental conditions used, it wasn\'t possible to find any correlation between (µS\'-S) and v. Otherwise, it was found a correlation between v and µX (growth rate) during unsteady-state. Such correlation was well demonstrated in steady-state tests: v- - 0.54 + 10.66 µX (r = 0.94) The other main features of the experimental results obtained in steady-state continuous experiments are: a) µX and (µS\'-S), for experiments carried out under anaerobic conditions, were higher than the same parameters for experiments carried out under aerobic conditions, regardless if the molasses had been supplemented or not; b) v- varied as follows: (aerated culture with supplemented medium) > (non aerated culture with or without supplemented medium) > (aerobic culture with non supplemented medium); c) the yield factor varied as follows: (aerated culture with supplemented medium) > (aerated culture with non supplemented medium) > (non-aerated culture with or without supplemented medium). The correlation between v and µX was an evidence that the measured values of v represent the total invertase activity of the cell, and has no relation with the fraction of invertase that produced the reducing sugars assimilated by the cells. Otherwise, it seems possible to assure that the sample manipulatian did not affect the cell structure and that, cansequently, the measured enzyme activity represents the actual invertase activity af the growing cells. The oscillatory phenomena could then be considered as a variation of the invertase-sucrose interaction due to different positions of the invertase molecules on the cell wall during the cell growth.