[ES] La Biología Sintética de Plantas es un campo en rápida expansión, con un gran potencial para potenciar la producción de compuestos en plantas. Las plantas pueden actuar como biofactorías sostenibles y económicas para la producción de moléculas de alto valor; sin embargo, la producción continua a menudo genera problemas de toxicidad para la propia planta y bajos rendimientos. Un objetivo clave en este ámbito es lograr un control preciso e inducible sobre la expresión génica mediante circuitos genéticos sintéticos que incluyen sensores y procesadores modulares. Esta tesis se centra en el desarrollo de un sensor de cobre y procesadores basados en geminivirus, diseñados como componentes modulares para circuitos sintéticos en Nicotiana benthamiana, una planta modelo con gran potencial para transformaciones génicas tanto transitorias como estables. El primer capítulo de esta tesis presenta un sistema de expresión génica inducible por cobre, diseñado para permitir una regulación precisa dependiente de sulfato de cobre (CuSO4). Este sistema incluye un elemento sensor compuesto por un factor de transcripción que se une al cobre, CUP2, fusionado al dominio de activación Gal4 y un promotor sintético con sitios de unión al cobre (CBS) ubicado antes de un promotor mínimo. El sensor de cobre se utilizó exitosamente para controlar un activador transcripcional programable basado en CRISPR/dCas9 (dCasEV2.1) en N. benthamiana. Este sensor, combinado con el procesador dCasEV2.1 (CS/dCasEV2.1), confirió un control robusto de la expresión génica, con mínima actividad basal y fuerte activación en respuesta a cobre, ofreciendo una herramienta robusta para la activación específica de genes endógenos. Este sistema tiene un gran potencial para la regulación dirigida de genes en Biología Sintética de Plantas, especialmente en aplicaciones que requieren activación bajo demanda y baja expresión de fondo. El segundo capítulo se centra en el desarrollo de un circuito de amplificación génica regulado por cobre, denominado CuBe, en referencia al ion cobre (Cu²⁺) y al virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV). CuBe combina el sensor de cobre con un vector replicativo derivado específicamente del geminivirus BeYDV y sus correspondientes proteínas asociadas a replicación (Rep/RepA). Esta combinación permite la activación inducida por cobre del replicón y la posterior expresión de proteínas recombinantes en N. benthamiana. Diseñado para lograr una baja expresión basal y alta inducibilidad, CuBe facilita la producción controlada de proteínas de interés farmacéutico, como anticuerpos. Se generaron líneas transgénicas estables con CuBe, confirmando su funcionalidad a largo plazo y robustez con métodos alternativos de aplicación de cobre, como en post-cosecha e hidroponía. Este sistema destaca el potencial de los circuitos regulados por cobre para aplicaciones escalables de Agricultura Molecular en condiciones controladas. El tercer capítulo amplía el uso de sistemas basados en geminivirus investigando y optimizando varios vectores geminivirales (derivados de BeYDV, TYLCV y BCTV) para aplicaciones en biotecnología vegetal. Utilizando un sistema reportero de bioluminiscencia autosostenida, este estudio caracteriza la dinámica y los niveles de expresión basal de diferentes configuraciones de vectores, evaluando su eficacia para la expresión transitoria de una enzima recombinante ligada a la bioluminiscencia. Estos análisis proporcionaron información sobre los puntos fuertes y las limitaciones de cada vector para aplicaciones específicas, como la expresión de múltiples genes, lo que enriquece el conjunto de herramientas geminivirales disponibles para la Biología Sintética de Plantas. / [CA] La Biologia Sintètica de Plantes és un camp en ràpida expansió, amb un gran potencial per a potenciar la producció de compostos en plantes. Les plantes poden actuar com biofactories sostenibles i econòmiques per a la producció de molècules d'alt valor; no obstant això, la producció contínua sovint genera problemes de toxicitat per a la pròpia planta i baixos rendiments. Un objectiu clau en aquest àmbit és aconseguir un control precís i induïble sobre l'expressió gènica mitjançant circuits genètics sintètics que inclouen sensors i processadors modulars. Aquesta tesi se centra en el desenvolupament d'un sensor de coure i processadors basats en geminivirus, dissenyats com a components modulars per a circuits sintètics en Nicotiana benthamiana, una planta model amb gran potencial per a transformacions gèniques tant transitòries com estables. El primer capítol d'aquesta tesi presenta un sistema d'expressió gènica induïble per coure, dissenyat per a permetre una regulació precisa dependent de sulfat de coure (CuSO4). Aquest sistema inclou un element sensor compost per un factor de transcripció que s'uneix al coure, CUP2, fusionat al domini d'activació Gal4 i un promotor sintètic amb llocs d'unió al coure (CBS) situat abans d'un promotor mínim. El sensor de coure es va utilitzar amb èxit per a controlar un activador transcripcional programable basat en CRISPR/dCas9 (dCasEV2.1) en N. benthamiana. Aquest sensor, combinat amb el processador dCasEV2.1 (CS/dCasEV2.1), va conferir un control robust de l'expressió gènica, amb mínima activitat basal i forta activació en resposta a coure, oferint una eina robusta per a l'activació específica de gens endògens. Aquest sistema té un gran potencial per a la regulació dirigida de gens en Biologia Sintètica de Plantes, especialment en aplicacions que requereixen activació sota demanda i baixa expressió de fons. El segon capítol se centra en el desenvolupament d'un circuit d'amplificació gènica regulat per coure, denominat CuBe, en referència a l'ió coure (Cu²¿) i al virus del nanisme groc del fesol (BeYDV). CuBe combina el sensor de coure amb un vector replicatiu derivat específicament del geminivirus BeYDV i les seues corresponents proteïnes associades a replicació (Rep/RepA). Aquesta combinació permet l'activació induïda per coure del replicon i la posterior expressió de proteïnes recombinants en N. benthamiana. Dissenyat per a aconseguir una baixa expressió basal i alta inducibilitat, CuBe facilita la producció controlada de proteïnes d'interés farmacèutic, com a anticossos. Es van generar línies transgèniques estables amb CuBe, confirmant la seua funcionalitat a llarg termini i robustesa amb mètodes alternatius d'aplicació de coure, com en post-collita i hidroponia. Aquest sistema destaca el potencial dels circuits regulats per coure per a aplicacions escalables d'Agricultura Molecular en condicions controlades. El tercer capítol amplia l'ús de sistemes basats en geminivirus investigant i optimitzant diversos vectors geminivirals (derivats de BeYDV, TYLCV i BCTV) per a aplicacions en biotecnologia vegetal. Utilitzant un sistema reporter de bioluminescència autosostinguda, aquest estudi caracteritza la dinàmica i els nivells d'expressió basal de diferents configuracions de vectors, avaluant la seua eficàcia per a l'expressió transitòria d'un enzim recombinant lligat a la bioluminescència. Aquestes anàlisis van proporcionar informació sobre els punts forts i les limitacions de cada vector per a aplicacions específiques, com l'expressió de múltiples gens, la qual cosa enriqueix el conjunt d¿eines geminivirals disponibles per a la Biologia Sintètica de Plantes. / [EN] Plant Synthetic Biology is a rapidly advancing field with significant potential to enhance plant-based biomanufacturing. Plants can serve as sustainable and cost-effective biofactories for producing valuable compounds, yet sustained production often leads to issues like toxicity for the plant itself and low yield. A major goal in plant biomanufacturing is to enable precise and inducible control over gene expression through the use of synthetic gene circuits containing modular sensor and processor elements. This thesis focuses on the development of a copper sensor and geminivirus-based processors, designed as modular components for synthetic gene circuits in Nicotiana benthamiana, a model plant with strong potential for transient and stable gene transformation. The first chapter of this thesis presents a copper-inducible gene expression system designed to achieve precise, copper sulfate (CuSO4)-dependent regulation of transcriptional activation. This system comprises a sensor element consisting of the copper-binding transcription factor CUP2 fused to the Gal4 activation domain, and a synthetic promoter containing copper-binding sites (CBS) positioned upstream of a minimal promoter. The copper sensor was successfully applied to control the activation of a CRISPR/dCas9-based programmable transcriptional activator (dCasEV2.1) in N. benthamiana. The copper sensor, combined with the dCasEV2.1 processor (CS/dCasEV2.1), conferred robust control of gene expression, with minimal basal activity and strong activation in response to copper sulfate, providing a reliable tool for fine-tuned induction of endogenous genes. This system offers significant potential for targeted gene regulation in Plant Synthetic Biology, especially for applications requiring on-demand activation with minimal background expression. The second chapter focuses on the development of a copper-regulated gene amplification circuit called CuBe, which takes its name from the chemical symbol for copper (Cu²¿) and the initials of the bean yellow dwarf virus (BeYDV). In this system, the copper sensor is combined with a replicative vector and the associated replication proteins (Rep/RepA), both derived from BeYDV. This integration enables copper-inducible activation of the replicon, allowing for controlled expression of recombinant proteins in N. benthamiana. Designed to achieve low basal expression and high inducibility, CuBe facilitates controlled expression of recombinant proteins with pharmaceutical relevance, such as antibodies. Stable transgenic lines carrying CuBe were generated, confirming its long-term functionality and robustness with alternative copper application methods, including post-harvest and hydroponic. The CuBe system highlights the potential of copper-inducible circuits for scalable Molecular Farming applications in controlled conditions. The third chapter expands on geminivirus-based systems by investigating and optimizing various geminiviral vectors (derived from BeYDV, TYLCV, and BCTV) for plant biotechnology applications. Using a self-sustained bioluminescence-based reporter system, this study characterizes the dynamics and basal expression levels of different vector configuration, comparing their efficacy for the transient expression of a recombinant enzyme linked to bioluminescence. These analyses provided insights into the strengths and limitations of each vector for specific applications, such as multi-gene expression, thereby enhancing the geminiviral toolbox available for Plant Synthetic Biology. In conclusion, this thesis contributes novel tools for Plant Synthetic Biology, with significant implications for Molecular Farming and plant-based biocomputing. By integrating inducible systems with optimized vector design, this research provides a foundation for future advancements in synthetic gene circuits tailored for plant biotechnology applications that demand tightly regulated and customizable gene expression. / Esta tesis doctoral ha sido financiada mediante la Subvención para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral (ACIF/2020/309) de la Generalitat Valenciana. / García Pérez, E. (2025). Development of a Copper Sensor and Geminivirus-Based Processors for Engineering Synthetic Gene Circuits in Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/214743