[ES] Plant Molecular Farming (PMF) es la producción de proteínas de interés industrial y valor comercial en plantas. Su objetivo es proporcionar un enfoque seguro y rentable para la producción de proteínas recombinantes a gran escala. Las plantas del género Nicotiana, especialmente Nicotiana tabacum y Nicotiana benthamiana, han adquirido una importancia creciente como plataformas de producción de PMF debido a sus ventajas, como el alto rendimiento de biomasa, la facilidad de transformación y la expresión robusta de proteínas. Sin embargo, en la actualidad N. tabacum y N. benthamiana no son hospedadores ideales para el cultivo molecular. Los objetivos de mejora genética, como retrasar o suprimir la floración para aumentar la biomasa de la planta, podrían convertir a N. benthamiana en un chasis de primera para fines de cultivo molecular. En este trabajo de investigación nos centramos en este objetivo. En el primer capítulo, realizamos un análisis de todo el genoma de los genes SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), implicados en la transición de fase vegetativa y el tiempo de floración, en esta especie y en su pariente cercana N. tabacum, identificando 49 genes SPL en N. tabacum y 43 genes SPL en N. benthamiana. Los genes SPL de las dos especies se clasificaron en ocho grupos filogenéticos de acuerdo con la clasificación de SPL en Arabidopsis thaliana. La estructura génica exón-intrón y los dominios de unión al ADN se conservaron en gran medida entre homeólogos y ortólogos, y también se identificaron las dianas potenciales del microARN156, implicado en la transición de fase vegetativa. La expresión de genes SPL en hojas se analizó mediante RNA-seq en tres fases de crecimiento diferentes, revelando que los genes que no estaban bajo el control de miR156 se expresaban en general de forma constitutiva a niveles altos, mientras que los genes regulados por miR156 mostraban niveles de expresión más bajos, a menudo regulados por el desarrollo. Seleccionamos el gen SPL13_1a de N. benthamiana como diana para un experimento de knockout CRISPR/Cas9. El knock out completo de este único gen condujo a un retraso significativo en el tiempo de floración de 2-5 días y a un aumento de la ramificación. En el segundo capítulo, mostramos más ediciones de genes CRISPR/Cas9 realizadas en N. benthamiana con el objetivo de la abolición de la floración. Se eliminaron los inductores florales FLOWERING LOCUS T 4 y 5 (NbFT4 y NbFT5_1a/1b) solos y en combinación con NbSPL13_1a. En la línea más editada FT4-FT5-SPL13 40-1 el tiempo de floración se duplicó en comparación con las plantas de tipo silvestre. Sin embargo, no se logró la abolición total de la floración. El retraso de la floración tuvo consecuencias en varios aspectos del crecimiento de la planta, que cuantificamos a través de diversos parámetros: las líneas altamente editadas presentaron un aumento de la biomasa, la altura, el número de hojas y el área foliar total en comparación con las menos editadas y el tipo silvestre. Además, se evaluó el potencial de las líneas generadas para expresar proteínas heterólogas. Inesperadamente, no fueron capaces de mantener altos niveles de expresión después de la quinta semana. En el futuro, se apilarán en nuestras líneas knockouts en otros actores importantes en el inicio de la floración, como NbSPL9/15 y NbSPL3/4/5. / [CA] Plant Molecular Farming (PMF) és la producció de proteïnes d'interès industrial i valor comercial a plantes. El seu objectiu és proporcionar un enfocament segur i rendible per a la producció de proteïnes recombinants a gran escala. Les plantes del gènere Nicotiana, especialment Nicotiana tabacum i Nicotiana benthamiana, han adquirit una importància creixent com a plataformes de producció de PMF a causa dels seus avantatges, com ara l'alt rendiment de biomassa, la facilitat de transformació i l'expressió robusta de proteïnes. No obstant això, actualment la N. tabacum i la N. benthamiana no són hostes ideals per al cultiu molecular. Els objectius de millora genètica, com ara endarrerir o suprimir la floració per augmentar la biomassa de la planta, podrien convertir N. benthamiana en un xassís de primera per a fins de cultiu molecular. En aquest treball de recerca ens centrem en aquest objectiu. Al primer capítol, realitzem una anàlisi de tot el genoma dels gens SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), implicats en la transició de fase vegetativa i el temps de floració, en aquesta espècie i en el seu parent proper N. tabacum, identificant 49 gens SPL a N. tabacum i 43 gens SPL a N. benthamiana. Els gens SPL de les dues espècies es van classificar en vuit grups filogenètics d'acord amb la classificació de SPL a Arabidopsis thaliana. L'estructura gènica exón-intron i els dominis d'unió a l'ADN es van conservar en gran mesura entre homeòlegs i ortòlegs, i també es van identificar les potencials dianes del microARN156, implicat en la transició de fase vegetativa. L'expressió de gens SPL en fulles es va analitzar mitjançant RNA-seq en tres fases de creixement diferents, revelant que els gens que no estaven sota el control de miR156 s'expressaven en general de forma constitutiva a nivells alts, mentre que els gens regulats per miR156 mostraven nivells més baixos d'expressió, sovint regulats pel desenvolupament. Seleccionem el gen SPL13_1a de N. benthamiana com a diana per a un experiment de knockout CRISPR/Cas9. El knock out complet d'aquest gen va conduir a un retard significatiu en el temps de floració de 2-5 dies ia un augment de la ramificació. Al segon capítol, mostrem més edicions de gens CRISPR/Cas9 realitzades a N. benthamiana amb l'objectiu de l'abolició de la floració. Es van eliminar els inductors florals FLOWERING LOCUS T 4 i 5 (NbFT4 i NbFT5_1a/1b) sols i en combinació amb NbSPL13_1a. A la línia més editada FT4-FT5-SPL13 40-1 el temps de floració es va duplicar en comparació amb les plantes de tipus silvestre. Tot i això, no es va aconseguir l'abolició total de la floració. El retard de la floració va tenir conseqüències en diversos aspectes del creixement de la planta, que vam quantificar a través de diversos paràmetres: les línies altament editades van presentar un augment de la biomassa, l'alçada, el nombre de fulles i l'àrea foliar total en comparació amb les menys editades i el tipus silvestre. A més, es va avaluar el potencial de les línies generades per expressar proteïnes heteròlogues. Inesperadament, no van ser capaços de mantenir alts nivells dexpressió després de la cinquena setmana. En el futur, s'apilaran a les nostres línies knockouts en altres actors importants a l'inici de la floració, com NbSPL9/15 i NbSPL3/4/5. / [EN] The term Plant Molecular farming (PMF) refers to the production of industrially relevant and commercially valuable recombinant products in plants. Its purpose is to provide a safe and cost-effective approach for the manufacturing of recombinant bioproducts at a large scale. Plants of the Nicotiana genus, especially Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana, have become increasingly important as production platforms for PMF due to their advantages such as high biomass yield, ease of transformation, and robust protein expression. However, at present, there is room for improvement for N. tabacum and N. benthamiana as ideal hosts for molecular farming. Breeding goals such as delaying or abolishing flowering to enhance plant biomass could convert N. benthamiana into a prime chassis for molecular farming purposes. This objective was the focus of this research. In the first chapter, a genome-wide analysis of SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL) genes was performed. These genes are involved in vegetative phase transition and flowering time, on this species and its close relative N. tabacum, identifying 49 SPL genes in N. tabacum and 43 SPL genes in N. benthamiana. The SPL genes of the two species were classified into eight phylogenetic groups according to the SPL classification in Arabidopsis thaliana. The exon-intron gene structure and the DNA-binding domains were highly conserved between homeologues and orthologues, and the potential targets of microRNA156, involved in vegetative phase transition, were also identified. The expression of SPL genes in leaves was analysed by RNA-seq at three different growth stages, revealing that genes not under miR156 control were in general constitutively expressed at high levels, whereas miR156-regulated genes showed lower expression levels, often developmentally regulated. The N. benthamiana SPL13_1a gene was selected as target for a CRISPR/Cas9 knockout experiment. The full knock out of this single gene lead to a significant delay in flowering time of 2-5 days and increased branching. In the second chapter, more CRISPR/Cas9 gene editions are performed in N. benthamiana with the objective of flowering abolition. Floral inducers FLOWERING LOCUS T 4 and 5 (NbFT4 and NbFT5_1a/1b) were knocked out alone and in combination with NbSPL13_1a. In the most edited line FT4-FT5-SPL13 40-1 flowering time was doubled compared to wild type plants. However, total abolition of flowering was not achieved. The delayed flowering had consequences on various aspects of plant growth, that were quantified through various parameters: highly edited lines had increased biomass, height, number of leaves and total leaves area compared to the less edited ones and wild type. Moreover, the generated lines were evaluated for their potential to express heterologous proteins. Unexpectedly, they were not able to maintain high expression levels after week five. In the future, knockouts in other important players in flowering initiation, such as NbSPL9/15 and NbSPL3/4/5, will be stacked in our lines. / Paola, CD. (2024). Enhancing Nicotiana benthamiana as chassis for Molecular Farming: targeting flowering time for increased biomass and recombinant protein production [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204803

[ES] La Biología Sintética de Plantas es un campo en rápida expansión, con un gran potencial para potenciar la producción de compuestos en plantas. Las plantas pueden actuar como biofactorías sostenibles y económicas para la producción de moléculas de alto valor; sin embargo, la producción continua a menudo genera problemas de toxicidad para la propia planta y bajos rendimientos. Un objetivo clave en este ámbito es lograr un control preciso e inducible sobre la expresión génica mediante circuitos genéticos sintéticos que incluyen sensores y procesadores modulares. Esta tesis se centra en el desarrollo de un sensor de cobre y procesadores basados en geminivirus, diseñados como componentes modulares para circuitos sintéticos en Nicotiana benthamiana, una planta modelo con gran potencial para transformaciones génicas tanto transitorias como estables. El primer capítulo de esta tesis presenta un sistema de expresión génica inducible por cobre, diseñado para permitir una regulación precisa dependiente de sulfato de cobre (CuSO4). Este sistema incluye un elemento sensor compuesto por un factor de transcripción que se une al cobre, CUP2, fusionado al dominio de activación Gal4 y un promotor sintético con sitios de unión al cobre (CBS) ubicado antes de un promotor mínimo. El sensor de cobre se utilizó exitosamente para controlar un activador transcripcional programable basado en CRISPR/dCas9 (dCasEV2.1) en N. benthamiana. Este sensor, combinado con el procesador dCasEV2.1 (CS/dCasEV2.1), confirió un control robusto de la expresión génica, con mínima actividad basal y fuerte activación en respuesta a cobre, ofreciendo una herramienta robusta para la activación específica de genes endógenos. Este sistema tiene un gran potencial para la regulación dirigida de genes en Biología Sintética de Plantas, especialmente en aplicaciones que requieren activación bajo demanda y baja expresión de fondo. El segundo capítulo se centra en el desarrollo de un circuito de amplificación génica regulado por cobre, denominado CuBe, en referencia al ion cobre (Cu²⁺) y al virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV). CuBe combina el sensor de cobre con un vector replicativo derivado específicamente del geminivirus BeYDV y sus correspondientes proteínas asociadas a replicación (Rep/RepA). Esta combinación permite la activación inducida por cobre del replicón y la posterior expresión de proteínas recombinantes en N. benthamiana. Diseñado para lograr una baja expresión basal y alta inducibilidad, CuBe facilita la producción controlada de proteínas de interés farmacéutico, como anticuerpos. Se generaron líneas transgénicas estables con CuBe, confirmando su funcionalidad a largo plazo y robustez con métodos alternativos de aplicación de cobre, como en post-cosecha e hidroponía. Este sistema destaca el potencial de los circuitos regulados por cobre para aplicaciones escalables de Agricultura Molecular en condiciones controladas. El tercer capítulo amplía el uso de sistemas basados en geminivirus investigando y optimizando varios vectores geminivirales (derivados de BeYDV, TYLCV y BCTV) para aplicaciones en biotecnología vegetal. Utilizando un sistema reportero de bioluminiscencia autosostenida, este estudio caracteriza la dinámica y los niveles de expresión basal de diferentes configuraciones de vectores, evaluando su eficacia para la expresión transitoria de una enzima recombinante ligada a la bioluminiscencia. Estos análisis proporcionaron información sobre los puntos fuertes y las limitaciones de cada vector para aplicaciones específicas, como la expresión de múltiples genes, lo que enriquece el conjunto de herramientas geminivirales disponibles para la Biología Sintética de Plantas. / [CA] La Biologia Sintètica de Plantes és un camp en ràpida expansió, amb un gran potencial per a potenciar la producció de compostos en plantes. Les plantes poden actuar com biofactories sostenibles i econòmiques per a la producció de molècules d'alt valor; no obstant això, la producció contínua sovint genera problemes de toxicitat per a la pròpia planta i baixos rendiments. Un objectiu clau en aquest àmbit és aconseguir un control precís i induïble sobre l'expressió gènica mitjançant circuits genètics sintètics que inclouen sensors i processadors modulars. Aquesta tesi se centra en el desenvolupament d'un sensor de coure i processadors basats en geminivirus, dissenyats com a components modulars per a circuits sintètics en Nicotiana benthamiana, una planta model amb gran potencial per a transformacions gèniques tant transitòries com estables. El primer capítol d'aquesta tesi presenta un sistema d'expressió gènica induïble per coure, dissenyat per a permetre una regulació precisa dependent de sulfat de coure (CuSO4). Aquest sistema inclou un element sensor compost per un factor de transcripció que s'uneix al coure, CUP2, fusionat al domini d'activació Gal4 i un promotor sintètic amb llocs d'unió al coure (CBS) situat abans d'un promotor mínim. El sensor de coure es va utilitzar amb èxit per a controlar un activador transcripcional programable basat en CRISPR/dCas9 (dCasEV2.1) en N. benthamiana. Aquest sensor, combinat amb el processador dCasEV2.1 (CS/dCasEV2.1), va conferir un control robust de l'expressió gènica, amb mínima activitat basal i forta activació en resposta a coure, oferint una eina robusta per a l'activació específica de gens endògens. Aquest sistema té un gran potencial per a la regulació dirigida de gens en Biologia Sintètica de Plantes, especialment en aplicacions que requereixen activació sota demanda i baixa expressió de fons. El segon capítol se centra en el desenvolupament d'un circuit d'amplificació gènica regulat per coure, denominat CuBe, en referència a l'ió coure (Cu²¿) i al virus del nanisme groc del fesol (BeYDV). CuBe combina el sensor de coure amb un vector replicatiu derivat específicament del geminivirus BeYDV i les seues corresponents proteïnes associades a replicació (Rep/RepA). Aquesta combinació permet l'activació induïda per coure del replicon i la posterior expressió de proteïnes recombinants en N. benthamiana. Dissenyat per a aconseguir una baixa expressió basal i alta inducibilitat, CuBe facilita la producció controlada de proteïnes d'interés farmacèutic, com a anticossos. Es van generar línies transgèniques estables amb CuBe, confirmant la seua funcionalitat a llarg termini i robustesa amb mètodes alternatius d'aplicació de coure, com en post-collita i hidroponia. Aquest sistema destaca el potencial dels circuits regulats per coure per a aplicacions escalables d'Agricultura Molecular en condicions controlades. El tercer capítol amplia l'ús de sistemes basats en geminivirus investigant i optimitzant diversos vectors geminivirals (derivats de BeYDV, TYLCV i BCTV) per a aplicacions en biotecnologia vegetal. Utilitzant un sistema reporter de bioluminescència autosostinguda, aquest estudi caracteritza la dinàmica i els nivells d'expressió basal de diferents configuracions de vectors, avaluant la seua eficàcia per a l'expressió transitòria d'un enzim recombinant lligat a la bioluminescència. Aquestes anàlisis van proporcionar informació sobre els punts forts i les limitacions de cada vector per a aplicacions específiques, com l'expressió de múltiples gens, la qual cosa enriqueix el conjunt d¿eines geminivirals disponibles per a la Biologia Sintètica de Plantes. / [EN] Plant Synthetic Biology is a rapidly advancing field with significant potential to enhance plant-based biomanufacturing. Plants can serve as sustainable and cost-effective biofactories for producing valuable compounds, yet sustained production often leads to issues like toxicity for the plant itself and low yield. A major goal in plant biomanufacturing is to enable precise and inducible control over gene expression through the use of synthetic gene circuits containing modular sensor and processor elements. This thesis focuses on the development of a copper sensor and geminivirus-based processors, designed as modular components for synthetic gene circuits in Nicotiana benthamiana, a model plant with strong potential for transient and stable gene transformation. The first chapter of this thesis presents a copper-inducible gene expression system designed to achieve precise, copper sulfate (CuSO4)-dependent regulation of transcriptional activation. This system comprises a sensor element consisting of the copper-binding transcription factor CUP2 fused to the Gal4 activation domain, and a synthetic promoter containing copper-binding sites (CBS) positioned upstream of a minimal promoter. The copper sensor was successfully applied to control the activation of a CRISPR/dCas9-based programmable transcriptional activator (dCasEV2.1) in N. benthamiana. The copper sensor, combined with the dCasEV2.1 processor (CS/dCasEV2.1), conferred robust control of gene expression, with minimal basal activity and strong activation in response to copper sulfate, providing a reliable tool for fine-tuned induction of endogenous genes. This system offers significant potential for targeted gene regulation in Plant Synthetic Biology, especially for applications requiring on-demand activation with minimal background expression. The second chapter focuses on the development of a copper-regulated gene amplification circuit called CuBe, which takes its name from the chemical symbol for copper (Cu²¿) and the initials of the bean yellow dwarf virus (BeYDV). In this system, the copper sensor is combined with a replicative vector and the associated replication proteins (Rep/RepA), both derived from BeYDV. This integration enables copper-inducible activation of the replicon, allowing for controlled expression of recombinant proteins in N. benthamiana. Designed to achieve low basal expression and high inducibility, CuBe facilitates controlled expression of recombinant proteins with pharmaceutical relevance, such as antibodies. Stable transgenic lines carrying CuBe were generated, confirming its long-term functionality and robustness with alternative copper application methods, including post-harvest and hydroponic. The CuBe system highlights the potential of copper-inducible circuits for scalable Molecular Farming applications in controlled conditions. The third chapter expands on geminivirus-based systems by investigating and optimizing various geminiviral vectors (derived from BeYDV, TYLCV, and BCTV) for plant biotechnology applications. Using a self-sustained bioluminescence-based reporter system, this study characterizes the dynamics and basal expression levels of different vector configuration, comparing their efficacy for the transient expression of a recombinant enzyme linked to bioluminescence. These analyses provided insights into the strengths and limitations of each vector for specific applications, such as multi-gene expression, thereby enhancing the geminiviral toolbox available for Plant Synthetic Biology. In conclusion, this thesis contributes novel tools for Plant Synthetic Biology, with significant implications for Molecular Farming and plant-based biocomputing. By integrating inducible systems with optimized vector design, this research provides a foundation for future advancements in synthetic gene circuits tailored for plant biotechnology applications that demand tightly regulated and customizable gene expression. / Esta tesis doctoral ha sido financiada mediante la Subvención para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral (ACIF/2020/309) de la Generalitat Valenciana. / García Pérez, E. (2025). Development of a Copper Sensor and Geminivirus-Based Processors for Engineering Synthetic Gene Circuits in Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/214743