京都大学 / 新制・論文博士 / 博士(農学) / 乙第13498号 / 論農博第2902号 / 新制||農||1093(附属図書館) / 学位論文||R4||N5404(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科農学専攻 / (主査)教授 中﨑 鉄也, 教授 土井 元章, 教授 田尾 龍太郎 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

[ES] En los cítricos, la baja temperatura promueve la inducción floral en otoño-invierno aumentando la expresión del gen promotor CiFT3 (homólogo en los cítricos del gen FLOWERING LOCUS T). La presencia de un gran número de frutos en el árbol durante ese momento inhibe la expresión de CiFT3 y la floración, pero se desconoce la señal inhibitoria que genera el fruto. Las hipótesis mayormente aceptadas proponen que la señal puede ser hormonal o nutricional. En el primer caso, el efecto inhibidor se atribuye a las hormonas que el fruto produce y exporta durante su desarrollo. En el segundo caso, el efecto inhibidor se atribuye a la alta demanda y consumo de carbohidratos por los frutos en desarrollo. Ambas hipótesis son complementarias y no excluyentes entre sí. Además, se ha demostrado que el fruto promueve la activación epigenética del represor de la floración CcMADS19 (homólogo en los cítricos del gen FLOWERING LOCUS C), que inhibe la expresión del gen CiFT3. Con el objetivo de determinar qué señal produce el fruto para inhibir la floración, en esta Tesis se propone la siguiente hipótesis: El fruto inhibe la floración a través de la síntesis y exportación de auxinas que activa la síntesis de giberelinas y, a su vez, la expresión de CcMADS19. Mediante experimentos con tratamientos exógenos de auxinas, giberelinas, y sus antagonistas, aclareo de frutos, y la interrupción del transporte por el floema entre el fruto y las yemas, los resultados indican que ni las giberelinas ni las auxinas se relacionan de forma consistente con la activación de la expresión de CcMADS19 en las hojas. En las yemas, las giberelinas se relacionan con la activación del gen inhibidor CENTRORRADIALIS (CEN), cuando hay fruto por aumento de la síntesis de GA4, y cuando no hay fruto por su aplicación exógena. La presencia del fruto aumenta la concentración de auxinas en el tallo y la yema en el momento de la inducción, y reprime su síntesis y trasporte. Pero esto no impide que, en la yema, el gen CcMADS19 esté epigenéticamente silenciado y que el silenciamiento se transmita a los nuevos brotes vegetativos. Estos brotes florecen en el siguiente ciclo, y, en sus yemas, la diferenciación floral se relaciona con un aumento de la síntesis y trasporte de auxinas y una reducción de la síntesis de giberelinas. / [CA] Als cítrics, les baixes temperatures promouen la inducció floral a la tardor i l'hivern augmentant l'expressió del gen promotor CiFT3 (homòleg en els cítrics del gen FLOWERING LOCUS T). La presència d'un gran nombre de fruita a l'arbre en aquest moment inhibeix l'expressió de CiFT3 i la floració, però es desconeix la senyal inhibidora que genera la fruita. Les hipòtesis majoritàriament acceptades proposen que la senyal pot ser hormonal o nutricional. En el primer cas, l'efecte inhibidor s'atribueix a les hormones que la fruita produeix i exporta durant el seu desenvolupament. En el segon cas, l'efecte inhibidor s'atribueix a la alta demanda i consum de carbohidrats per part de la fruita en desenvolupament. Ambdues hipòtesis són complementàries i no es descarten mútuament. A més, s'ha demostrat que la fruita promou l'activació epigenètica del repressor de la floració CcMADS19 (homòleg en els cítrics del gen FLOWERING LOCUS C), que inhibeix l'expressió del gen CiFT3. Amb l'objectiu de determinar quina senyal produeix la fruita per inhibir la floració, en aquesta Tesi es proposa la següent hipòtesi: La fruita inhibeix la floració mitjançant la síntesi i exportació d'auxines que activa la síntesi de giberelines i, al seu torn, l'expressió de CcMADS19. Mitjançant experiments amb tractaments exògens d'auxines, giberelines i els seus antagonistes, aclarida de fruita i la interrupció del transport pel floema entre la fruita i les brots, els resultats indiquen que ni les giberelines ni les auxines es relacionen de manera consistent amb l'activació de l'expressió de CcMADS19 a les fulles. A les gemmes, les giberelines es relacionen amb l'activació del gen inhibidor CENTRORRADIALIS (CEN) quan hi ha fruita per l'augment de la síntesi de GA4 i quan no hi ha fruita per la seua aplicació exògena. La presència de la fruita augmenta la concentració d'auxines a la tija i la gemma en el moment de la inducció i reprimeix la seua síntesi i transport. Però això no impedeix que, a la gemma, el gen CcMADS19 estigui epigenèticament silenciat i que el silenciament es transmeti als nous brots vegetatius. Aquests brots floreixen al següent cicle i, a les seues gemmes, la diferenciació floral es relaciona amb un augment de la síntesi i transport d'auxines i una reducció de la síntesi de giberelines. / [EN] In citrus, low temperature promotes flower induction in autumn-winter by increasing the expression of the CiFT3 promoter gene (citrus homologue of the FLOWERING LOCUS T gene). The presence of large numbers of fruits on the tree at this time inhibits CiFT3 expression and flowering, but the inhibitory signal produced by the fruits is unknown. The most widely accepted hypotheses are that the signal is hormonal or nutritional. In the first case, the inhibitory effect is attributed to hormones produced and exported by the fruit during development. In the second case, the inhibitory effect is attributed to the high demand and consumption of carbohydrates by the developing fruit. The two hypotheses are complementary and not mutually exclusive. In addition, it has been shown that the fruit promotes the epigenetic activation of the flowering repressor CcMADS19 (citrus homolog of the FLOWERING LOCUS C gene), which inhibits the expression of the CiFT3 gene. To determine which signal is produced by the fruit to inhibit flowering, the following hypothesis is proposed in this thesis: The fruit inhibits flowering through the synthesis and export of auxins, which activates the synthesis of gibberellins and, in turn, the expression of CcMADS19. Experiments with exogenous treatments of auxins, gibberellins and their antagonists, fruit thinning, and disruption of phloem transport between fruit and buds indicate that neither gibberellins nor auxins are consistently associated with the activation of CcMADS19 expression in leaves. In buds, gibberellins are associated with the activation of the flowering inhibitor CENTRORADIALIS (CEN), in the presence of fruit by increasing GA4 synthesis, and in the absence of fruit by its exogenous application. The presence of fruit increases the concentration of auxin in the stem and bud at the time of induction and suppresses its synthesis and transport. However, this does not prevent the epigenetic silencing of the CcMADS19 gene in the bud, which is transmitted to the leaves of the new vegetative shoots. These shoots flower in the following cycle, where floral differentiation is associated with an increase in auxin synthesis and transport and a decrease in gibberellin synthesis in the bud. / Marzal Blay, A. (2024). Study of the Fruit Inhibitory Mechanism on Citrus flowering. Nutritional, Hormonal and Genetic Factors [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203155

[ES] Plant Molecular Farming (PMF) es la producción de proteínas de interés industrial y valor comercial en plantas. Su objetivo es proporcionar un enfoque seguro y rentable para la producción de proteínas recombinantes a gran escala. Las plantas del género Nicotiana, especialmente Nicotiana tabacum y Nicotiana benthamiana, han adquirido una importancia creciente como plataformas de producción de PMF debido a sus ventajas, como el alto rendimiento de biomasa, la facilidad de transformación y la expresión robusta de proteínas. Sin embargo, en la actualidad N. tabacum y N. benthamiana no son hospedadores ideales para el cultivo molecular. Los objetivos de mejora genética, como retrasar o suprimir la floración para aumentar la biomasa de la planta, podrían convertir a N. benthamiana en un chasis de primera para fines de cultivo molecular. En este trabajo de investigación nos centramos en este objetivo. En el primer capítulo, realizamos un análisis de todo el genoma de los genes SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), implicados en la transición de fase vegetativa y el tiempo de floración, en esta especie y en su pariente cercana N. tabacum, identificando 49 genes SPL en N. tabacum y 43 genes SPL en N. benthamiana. Los genes SPL de las dos especies se clasificaron en ocho grupos filogenéticos de acuerdo con la clasificación de SPL en Arabidopsis thaliana. La estructura génica exón-intrón y los dominios de unión al ADN se conservaron en gran medida entre homeólogos y ortólogos, y también se identificaron las dianas potenciales del microARN156, implicado en la transición de fase vegetativa. La expresión de genes SPL en hojas se analizó mediante RNA-seq en tres fases de crecimiento diferentes, revelando que los genes que no estaban bajo el control de miR156 se expresaban en general de forma constitutiva a niveles altos, mientras que los genes regulados por miR156 mostraban niveles de expresión más bajos, a menudo regulados por el desarrollo. Seleccionamos el gen SPL13_1a de N. benthamiana como diana para un experimento de knockout CRISPR/Cas9. El knock out completo de este único gen condujo a un retraso significativo en el tiempo de floración de 2-5 días y a un aumento de la ramificación. En el segundo capítulo, mostramos más ediciones de genes CRISPR/Cas9 realizadas en N. benthamiana con el objetivo de la abolición de la floración. Se eliminaron los inductores florales FLOWERING LOCUS T 4 y 5 (NbFT4 y NbFT5_1a/1b) solos y en combinación con NbSPL13_1a. En la línea más editada FT4-FT5-SPL13 40-1 el tiempo de floración se duplicó en comparación con las plantas de tipo silvestre. Sin embargo, no se logró la abolición total de la floración. El retraso de la floración tuvo consecuencias en varios aspectos del crecimiento de la planta, que cuantificamos a través de diversos parámetros: las líneas altamente editadas presentaron un aumento de la biomasa, la altura, el número de hojas y el área foliar total en comparación con las menos editadas y el tipo silvestre. Además, se evaluó el potencial de las líneas generadas para expresar proteínas heterólogas. Inesperadamente, no fueron capaces de mantener altos niveles de expresión después de la quinta semana. En el futuro, se apilarán en nuestras líneas knockouts en otros actores importantes en el inicio de la floración, como NbSPL9/15 y NbSPL3/4/5. / [CA] Plant Molecular Farming (PMF) és la producció de proteïnes d'interès industrial i valor comercial a plantes. El seu objectiu és proporcionar un enfocament segur i rendible per a la producció de proteïnes recombinants a gran escala. Les plantes del gènere Nicotiana, especialment Nicotiana tabacum i Nicotiana benthamiana, han adquirit una importància creixent com a plataformes de producció de PMF a causa dels seus avantatges, com ara l'alt rendiment de biomassa, la facilitat de transformació i l'expressió robusta de proteïnes. No obstant això, actualment la N. tabacum i la N. benthamiana no són hostes ideals per al cultiu molecular. Els objectius de millora genètica, com ara endarrerir o suprimir la floració per augmentar la biomassa de la planta, podrien convertir N. benthamiana en un xassís de primera per a fins de cultiu molecular. En aquest treball de recerca ens centrem en aquest objectiu. Al primer capítol, realitzem una anàlisi de tot el genoma dels gens SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), implicats en la transició de fase vegetativa i el temps de floració, en aquesta espècie i en el seu parent proper N. tabacum, identificant 49 gens SPL a N. tabacum i 43 gens SPL a N. benthamiana. Els gens SPL de les dues espècies es van classificar en vuit grups filogenètics d'acord amb la classificació de SPL a Arabidopsis thaliana. L'estructura gènica exón-intron i els dominis d'unió a l'ADN es van conservar en gran mesura entre homeòlegs i ortòlegs, i també es van identificar les potencials dianes del microARN156, implicat en la transició de fase vegetativa. L'expressió de gens SPL en fulles es va analitzar mitjançant RNA-seq en tres fases de creixement diferents, revelant que els gens que no estaven sota el control de miR156 s'expressaven en general de forma constitutiva a nivells alts, mentre que els gens regulats per miR156 mostraven nivells més baixos d'expressió, sovint regulats pel desenvolupament. Seleccionem el gen SPL13_1a de N. benthamiana com a diana per a un experiment de knockout CRISPR/Cas9. El knock out complet d'aquest gen va conduir a un retard significatiu en el temps de floració de 2-5 dies ia un augment de la ramificació. Al segon capítol, mostrem més edicions de gens CRISPR/Cas9 realitzades a N. benthamiana amb l'objectiu de l'abolició de la floració. Es van eliminar els inductors florals FLOWERING LOCUS T 4 i 5 (NbFT4 i NbFT5_1a/1b) sols i en combinació amb NbSPL13_1a. A la línia més editada FT4-FT5-SPL13 40-1 el temps de floració es va duplicar en comparació amb les plantes de tipus silvestre. Tot i això, no es va aconseguir l'abolició total de la floració. El retard de la floració va tenir conseqüències en diversos aspectes del creixement de la planta, que vam quantificar a través de diversos paràmetres: les línies altament editades van presentar un augment de la biomassa, l'alçada, el nombre de fulles i l'àrea foliar total en comparació amb les menys editades i el tipus silvestre. A més, es va avaluar el potencial de les línies generades per expressar proteïnes heteròlogues. Inesperadament, no van ser capaços de mantenir alts nivells dexpressió després de la cinquena setmana. En el futur, s'apilaran a les nostres línies knockouts en altres actors importants a l'inici de la floració, com NbSPL9/15 i NbSPL3/4/5. / [EN] The term Plant Molecular farming (PMF) refers to the production of industrially relevant and commercially valuable recombinant products in plants. Its purpose is to provide a safe and cost-effective approach for the manufacturing of recombinant bioproducts at a large scale. Plants of the Nicotiana genus, especially Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana, have become increasingly important as production platforms for PMF due to their advantages such as high biomass yield, ease of transformation, and robust protein expression. However, at present, there is room for improvement for N. tabacum and N. benthamiana as ideal hosts for molecular farming. Breeding goals such as delaying or abolishing flowering to enhance plant biomass could convert N. benthamiana into a prime chassis for molecular farming purposes. This objective was the focus of this research. In the first chapter, a genome-wide analysis of SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL) genes was performed. These genes are involved in vegetative phase transition and flowering time, on this species and its close relative N. tabacum, identifying 49 SPL genes in N. tabacum and 43 SPL genes in N. benthamiana. The SPL genes of the two species were classified into eight phylogenetic groups according to the SPL classification in Arabidopsis thaliana. The exon-intron gene structure and the DNA-binding domains were highly conserved between homeologues and orthologues, and the potential targets of microRNA156, involved in vegetative phase transition, were also identified. The expression of SPL genes in leaves was analysed by RNA-seq at three different growth stages, revealing that genes not under miR156 control were in general constitutively expressed at high levels, whereas miR156-regulated genes showed lower expression levels, often developmentally regulated. The N. benthamiana SPL13_1a gene was selected as target for a CRISPR/Cas9 knockout experiment. The full knock out of this single gene lead to a significant delay in flowering time of 2-5 days and increased branching. In the second chapter, more CRISPR/Cas9 gene editions are performed in N. benthamiana with the objective of flowering abolition. Floral inducers FLOWERING LOCUS T 4 and 5 (NbFT4 and NbFT5_1a/1b) were knocked out alone and in combination with NbSPL13_1a. In the most edited line FT4-FT5-SPL13 40-1 flowering time was doubled compared to wild type plants. However, total abolition of flowering was not achieved. The delayed flowering had consequences on various aspects of plant growth, that were quantified through various parameters: highly edited lines had increased biomass, height, number of leaves and total leaves area compared to the less edited ones and wild type. Moreover, the generated lines were evaluated for their potential to express heterologous proteins. Unexpectedly, they were not able to maintain high expression levels after week five. In the future, knockouts in other important players in flowering initiation, such as NbSPL9/15 and NbSPL3/4/5, will be stacked in our lines. / Paola, CD. (2024). Enhancing Nicotiana benthamiana as chassis for Molecular Farming: targeting flowering time for increased biomass and recombinant protein production [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204803