L'ubiquinone, ou coenzyme Q, est une molécule lipophile polyisoprényle présente dans toutes les membranes biologiques chez les eucaryotes et composée d'un noyau aromatique actif de façon rédox et d'une chaîne grasse. Elle joue un rôle clef dans la chaîne respiratoire et est un important antioxydant membranaire. Chez l'homme, des pathologies sévères sont associées à des mutations de gènes de la biosynthèse de l'ubiquinone. Chez S. cerevisiæ, la biosynthèse de l'ubiquinone est réalisée par un complexe multiprotéique situé à la membrane interne mitochondriale. Certaines étapes de cette voie de biosynthèse ne sont pas encore connues et très peu ont été caractérisées in vitro. L'étude présentée ici a permis d'améliorer la compréhension de l'étape d'hydroxylation en C-5 à laquelle sont associés Coq6, monooxygénase à flavine, ainsi que Arh1 et Yah1, une adrénodoxine réductase et une adrénodoxine. Nous avons réalisé la première purification de Coq6 de S. cerevisiæ avec son cofacteur flavinique et nous avons démontré in vitro l'existence d'une chaîne de transfert d'électrons du NADPH au FAD de Coq6 via l'homologue humain de Arh1 et Yah1. Les études enzymatiques menées avec différents analogues de substrats synthétisés n'ont pas permis de détecter d'activité enzymatique de Coq6 dans les conditions utilisées. Des études préliminaires de fluorescence nous ont néanmoins permis d'avancer une hypothèse quant au substrat de Coq6, qui n'est pas connu avec certitude. Nous avons également réalisé une caractérisation cinétique de la réduction du FAD de l'homologue humain de Arh1 par le NADH et le NADPH, révélant ainsi son comportement particulier avec le NADPH, notamment en présence de Mg2+. / Coenzyme Q, or ubiquinone, is a lipophilic molecule found in all biological membranes in eukaryotes and composed of a redox active aromatic ring and a polyisoprenyl chain. It is a key electron carrier in the respiratory chain and a very important membrane soluble antioxidant. Severe pathologies in humans are associated with mutations in the ubiquinone biosynthesis genes. In S. cerevisiæ, ubiquinone biosynthesis is done by a multiproteic complex at the inner mitochondrial membrane. Some steps of the ubiquinone biosynthesis are still unknown and very few have been characterized in vitro. This study allowed us to better understand the C-5 hydroxylation step that is associated with Coq6, a flavin monooxygenase, Arh1, an adrenodoxin reductase and Yah1, an adrenodoxin. We achieved the first purification of S. cerevisiæ Coq6 with its flavin cofactor and we demonstrated in vitro the existence of an electron transfer chain from NADPH to Coq6 FAD via Arh1 human homologue and Yah1. Enzymatic studies made with several synthetic substrate analogues did not allow us to detect Coq6 enzymatic activity with the tested conditions. Nevertheless, preliminary fluorescence studies led us to make an assumption about Coq6 substrate which is still not well known. We also carried out a kinetic characterization of the NADPH or NADH reduction of Arh1 human homologue, showing its unusual behavior with NADPH, in particular when Mg2+ is present.

Coq6 est une enzyme impliquée dans la biosynthèse du coenzyme Q (aussi nommé ubiquinone, ou Q), un lipide benzoquinone polyprenylé essentiel à la fonction de la chaîne respiratoire mitochondriale. Dans la levure Saccharomyces cerevisiae, cette monooxygénase flavine-dépendante putatif est proposé pour hydroxyler le noyau benzénique d' un précurseur du coenzyme Q à la position C5. Nous montrons ici à travers des études biochimiques que Coq6 est une flavoprotéine utilisant le FAD comme cofacteur. Des modèles d'homologie du complexe Coq6-FAD ont étés réalisés et étudiés par dynamique moléculaire et arrimage moléculaire du 3-hexaprenyl-4-hydroxyphényl (4-HP6), un substrat modèle hydrophobe et volumineux. Nous identifions un canal d'accès putatif pour Coq6 dans un modèle de la forme sauvage et proposons des mutations in silico positionnés à l'entrée capable de partiellement (les mutations simples G248R et L382E) ou complètement (une double-mutation G248R-L382E) bloquer l'accès du substrat au site actif via le canal d' accès. Des essais in vivo soutiennent les prédictions in silico, qui expliquent l'abrogation ou la diminution des enzymes mutées. Ce travail fournit la première information structurale détaillée d'une enzyme importante et hautement conservée de biosynthèse de l'ubiquinone. / Coq6 is an enzyme involved in the biosynthesis of coenzyme Q, a polyisoprenylated benzoquinone lipid essential to the function of the mitochondrial respiratory chain. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, this putative flavin-dependent monooxygenase is proposed to hydroxylate the benzene ring of coenzyme Q (ubiquinone) precursor at position C5. We show here through biochemical studies that Coq6 is a flavoprotein using FAD as a cofactor. Homology models of the Coq6-FAD complex are constructed and studied through molecular dynamics and substrate docking calculations of 3-hexaprenyl-4-hydroxyphenol (4-HP6), a bulky hydrophobic model substrate. We identify a putative access channel for Coq6 in a wild type model and propose in silico mutations positioned at its entrance capable of partially (G248R and L382E single mutations) or completely (a G248R-L382E double-mutation) blocking access of the substrate to thechannel . Further in vivo assays support the computational predictions, thus explaining the decreased activities or inactivation of the mutated enzymes. This work provides the first detailed structural information of an important and highly conserved enzyme of ubiquinone biosynthesis.