SCRATCH2 é um fator de transcrição envolvido no desenvolvimento neural expresso em células pós-mitóticas. Identificamos que a retenção nuclear de SCRATCH2 é dada pelo domínio zinc-finger. A atividade repressora é modulada pelo domínio SCRATCH e não depende do domínio SNAG. O alinhamento de ortólogos de SCRATCH2 identificou uma sequência conservada na região N-terminal contendo os resíduos de fosforiláveis Y77 e S78. Mutação em Y77 ou S78 reduz a capacidade repressora de SCRATCH2, enquanto mutações em ambos resíduos resgatam sua função. Nossos dados sugerem que o domínio zinc-finger é responsável pela localização nuclear enquanto a atividade repressora é mediada pelo domínio SCRATCH. Já a identidade de Y77 e S78 é importante para a conformação correta proteína. O nocaute de SCRATCH2 aumenta a expressão de marcadores de progenitores intermediários (IP) e reduz o a expressão de marcadores de neurônios pós-mitóticos durante a neurodiferenciação de células-tronco. Esses dados sugerem que SCRATCH2 atua na manutenção de IP, e participa do início da diferenciação neural. / SCRATCH2 is a transcription factor involved in neural development expressed in postmitotic neural cells. Here, we identify that the nuclear retention of SCRATCH2 is controlled by the zinc-finger domain. The repressor activity is modulated by the SCRATCH domain and is independent of the SNAG domain. An analysis of SCRATCH2 through homology comparison identified a N-terminal conserved sequence containing two phosphorylatable residues, Y77 and S78. Single mutation in Y77 or S78 reduces SCRATCH2 repression ability while concomitant mutation in both rescue SCRATCH2 function. Our data suggest that the zinc-finger domain is responsible for nuclear retention of SCRATCH2 while residues Y77 and S78 are relevant for the protein correct conformation. In mouse embryonic stem cells neural induced towards corticogenesis, SCRATCH2 KO increases the levels of intermediate progenitors (IP) markers and reduces the level of early born neurons markers. This data suggests that SCRATCH2 plays a role in the maintenance of IP pool, thereby regulating the onset of neural differentiation.

Alix (ALG-2 Interacting Protein X) est une protéine cytoplasmique impliquée dans divers processus cellulaires allant de l'apoptose à la cytocinèse en passant par le bourgeonnement des virus, la réparation membranaire et la régulation de la voie endosomale. Toutes ces fonctions sont étroitement associées à l'interaction d'Alix avec ses partenaires impliqués dans la déformation des membranes telles que les endophilines A, Tsg-101 et CHMP4B du complexe ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport). Le but de ce projet est de caractériser le phénotype de la souris Alix ko récemment développée au laboratoire, dans l'espoir de mieux comprendre le rôle physiologique d'Alix. Ces souris, viables et fertiles, sont caractérisées par une microcéphalie apparaissant au cours de l'embryogenèse. Ce phénotype est accompagné d'une apoptose massive touchant les progéniteurs neuronaux durant la neurogenèse et d'une altération du développement de l'arborisation dendritique après la naissance. Les souris adultes présentent également des défauts de plasticité synaptique accompagnés d'une altération du recyclage des vésicules synaptiques. L'ensemble de ces processus repose sur la capacité d'Alix à contrôler le remodelage de la membrane plasmique. Au niveau moléculaire, nos travaux sur les neurones en cultures et sur les fibroblastes montrent une régulation de l'endocytose indépendante de la clathrine (CIE) par Alix et les endophilines A qui pourrait être à l'origine du phénotype neuronal de la souris. Cependant, l'association d'Alix avec CHMP4B du complexe ESCRT pourrait également être nécessaire au développement du système nerveux puisque l'interaction Alix-CHMP4B est nécessaire pour le contrôle de la CIE et de la mort neuronale.L'ensemble de ces résultats mets en évidence qu'à travers des mécanismes et des partenaires bien caractérisés, Alix est requise pour de nouvelles fonctions nécessaires au développement et au fonctionnement du système nerveux. / Alix (ALG-2 Interacting Protein X) is a cytoplasmic protein implicated in multiple processes including apoptosis, endosome function, membrane repair, viral budding and cytokinesis. Most of these involve modifications of plasma or endosomal membrane organization. Consistent with this, Alix is known to interact with diverse proteins modulating membrane deformation, such as endophilins or Tsg-101 and CHMP4B of the Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT). By studying the phenotype of Alix ko mice that we recently developed, we aim to better understand the precise role of Alix in vivo. These mice are viable and fertile but develop microcephaly even at embryonic stages. This microcephaly is associated with an increase of apoptosis in neural progenitor cells in embryos and a defect in neurite outgrowth at post-natal stages. Later on, these mice also develop defects in synaptic plasticity related to an alteration of synaptic vesicle recycling. All of these processes are tightly dependent on membrane shaping and remodelling. These features of the phenotype can be related to a new function of Alix with endophilin A in the control of clathrin-independent endocytosis (CIE), as described in Alix ko fibroblasts and cultured neurons. However, these defects might also be related to the well-known Alix partner CHMP4B, since we now know that this interaction is needed for controlling CIE and neuronal cell death.All together, these results shed light on novel functions of Alix in the developing and adult central nervous system, all relying on well-known molecular mechanisms and partners.

La cytoarchitecture du néocortex repose sur la coordination spatiotemporelle des taux de production des neurones ‐via la régulation du cycle cellulaire de leurs progéniteurs‐ et de leur migration radiale vers la surface corticale. Chez le primate, les couches supragranulaires de l'aire 17 sont plus développées que celles de l'aire 18, conséquence d'une prolifération et d'une production neuronale accrues dans l'aire 17 à E77‐80. Des observations en vidéomicroscopie bi‐photonique, sur tranches organotypiques de cortex, révèlent que la migration radiale est plus rapide dans l'aire 17. Les variations aire‐spécifiques des taux de prolifération et de migration neuronale sont donc congruentes. L'étude des mécanismes moléculaires qui sous‐tendent la régulation coordonnée de la prolifération et de la migration est centrée sur le régulateur du cycle cellulaire p27kip1, qui via son domaine C‐terminal promeut la migration en inhibant la GTPase RhoA. Ce rôle pléiotrope de p27 a été exploré dans la migration nucléaire intercinétique (INM) qu'effectuent les précurseurs de la zone ventriculaire corticale, en synchronie avec les phases du cycle cellulaire. Des formes mutantes de p27 ou des shRNA ont été électroporés spécifiquement dans les neuroblastes d'embryons murins à E14‐15. Des observations en vidéomicroscopie bi‐photonique sur tranches organotypiques révèlent que le domaine C-terminal de p27 affecte l'INM, promeut les décisions différenciatives et la migration radiale. P27 se place donc au sein d'un réseau moléculaire contrôlant conjointement, et de façon aire-spécifique, les divisions successives des précurseurs corticaux, ainsi que la migration des neurones qui en sont issus / Cortical cytoarchitecture relies on the spatiotemporal coordination of neuronal production rate, precursors cell-cycle control and neuronal radial migration towards the cortical plate. In the primate, area 17 supragranular layers are more developed than in area 18, due to higher proliferation and neuronal production rates in area 17 between E77-80. Two-photon videomicroscopy observations on cortical organotypic slices revealed that radial migration is faster in area 17 than 18. This indicates that area-specific variations of proliferation and migration rates are congruent during corticogenesis. The study of molecular mechanisms underlying the coordinated regulation of proliferation and migration focused on the cell-cycle regulator p27kip1, which promotes migration, via inhibition of the Rhoa GTPase by its C-terminal domain. This p27 dual function could play a major role during the Interkinetic Nuclear Migration (INM) performed by cortical precursor cells from the ventricular zone, in synchrony with the cell-cycle phases. Mutant forms of p27 or shRNA were electroporated into neuroblasts of E14-15 mice embryos. Two-photon videomicroscopy observations on organotypic slices revealed that p27 affects INM, promotes differentiative divisions and neuronal radial migration, though its C-terminal domain. P27 is thus part of a molecular network which finely tunes, in an area-specific manner, the successive rounds of divisions of precursor, as well as the migratory behavior of the newborn neurons

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