Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se ha observado que cepas de Corynebacterium pseudotuberculosis provenientes de diferentes especies animales tienen características fenotípicas y genotípicas particulares. C. pseudotuberculosis en medios líquidos, se desarrolla formando grumos, esto se debe a que el microorganismo se organiza en agregados bacterianos embebidos en una matriz de exopolisacáridos. El objetivo de este trabajo fue determinar diferencias en la capacidad de producción de exopolisacáridos entre cepas de C. pseudotuberculosis provenientes de equinos, ovinos y caprinos. Se estudiaron 4 cepas de cada especie, las que fueron cultivadas para cuantificar su producción de exopolisacáridos mediante el método fenol-ácido sulfúrico. Se determinó que no existen diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) entre cepas provenientes de equinos, ovinos y caprinos. Sin embargo, la variabilidad en producción de exopolisacárido de las cepas de C. pseudotuberculosis estudiadas, independientemente de la especie animal de origen, sugiere que se realicen investigaciones posteriores para identificar las causas de esa variabilidad

A escassez de dados sobre tuberculose e micobacterioses em ovinos (Ovis aries) motivou o presente trabalho de isolamento e tipificação de microorganismos presentes em linfonodos e lesões macroscópicas sugestivas de tuberculose. Foram avaliados pelo teste tuberculinico, 353 ovinos das raças Santa Inês e Texel de duas propriedades da região de Pindamonhangaba - São Paulo. Dos 57 animais selecionados para abate, 31 apresentavam reação ao PPD bovino maior que ao PPD aviário e 26 com reação ao PPD bovino menor que ao PPD aviário. Onze animais (19,3%) apresentaram na necrópsia lesões sugestivas de tuberculose. Os órgãos afetados foram o fígado, linfonodo submandibular, intestino, pulmão, linfonodo mediastino e glândula mamária. Foram isoladas micobactérias de sete (12,3%) animais e a tipificação genética pelo método de PRA demonstrou cinco (71,42%) infectados pelo Mycobacterium flavescens 1, um (14,28%) pelo M. kansasi, e um (14,28%) por micobactéria pertencente ao Complexo M. tuberculosis. Exames bacteriológicos para outras bactérias e/ou fungos isolaram Corynebacterium pseudotuberculosis em quatro (7,01%) dos 57 animais abatidos. Houve isolamento simultâneo de micobactérias e de Corynebacterium pseudotuberculosis em dois (3,5%) dos 57 animais abatidos. Os exames histopatológicos apontaram em nove (15,78%) animais a presença de granuloma e coloração de Ziehl-Neelsen positivo. A análise dos resultados obtidos permitiram concluir que, neste trabalho, os testes imunoalérgicos (Teste Cervical Simples e Teste Cervical Comparativo) não foram capazes de diferenciar infecção provocada pelo M. flavescens 1, M. kansasi, complexo M. tuberculosis e C. pseudotuberculosis. Nos exames macroscópico e histopatológico lesões provocadas por M. flavescens 1, M. kansasi, e C. pseudotuberculosis não foram diferenciáveis das provocadas pelo complexo M. tuberculosis. / The occurrence of few data on ovine (Ovis aries) tuberculosis and mycobacteriosis has motivated this work of isolation and typing microorganism found in lymph nodes and tuberculosis-like gross lesions. Tuberculin skin test was performed in 353 Santa Ines and Texel ovine breeds of two properties located at Pindamonhangaba Municipality - Sao Paulo State. Fifty seven animals were selected to be slaughtered and 31 of them had the bovine PPD skin test higher than avian PPD and other 26 presented bovine PPD reaction lower than avian PPD. Eleven animals (19.3%) showed tuberculosis-like gross lesions at necropsy. Most affected organs were liver, submandibular lymph nodes, intestines, lungs, mediastinic lymph nodes and mammary gland. It was possible to isolate mycobacteria from seven (12.3%) animals and genetic typing by the PRA method showed that five animals (71.42%) were infected with Mycobacterium flavescens 1, one (14.28%) with M. kansasi, and one (14.28%) with M. tuberculosis complex mycobacteria. Bacteriological culture isolation for other bacteria and/or fungi were positive for Corynebacterium pseudotuberculosis in four (7.01%) of 57 slaughtered animals. There was a concomitant isolation of mycobacteria and Corynebacterium pseudotuberculosis in two (3.5%) of 57 slaughtered animals. Histopathologic examination demonstrated the presence of granuloma and positive Ziehl-Neelsen staining in nine (15.78%) animals. Results analysis allowed concluding that in this work, immuno-allergic tests (Simple Cervical Test and Comparative Cervical Test) were not capable to differentiate infection caused by M. flavescens 1, M. kansasi, M. tuberculosis complex and C. pseudotuberculosis. During gross examination and histopathology, lesions caused by M. flavescens 1, M. kansasi, and C. pseudotuberculosis were not distinguishable from those caused by M. tuberculosis complex.

A escassez de dados sobre tuberculose e micobacterioses em ovinos (Ovis aries) motivou o presente trabalho de isolamento e tipificação de microorganismos presentes em linfonodos e lesões macroscópicas sugestivas de tuberculose. Foram avaliados pelo teste tuberculinico, 353 ovinos das raças Santa Inês e Texel de duas propriedades da região de Pindamonhangaba - São Paulo. Dos 57 animais selecionados para abate, 31 apresentavam reação ao PPD bovino maior que ao PPD aviário e 26 com reação ao PPD bovino menor que ao PPD aviário. Onze animais (19,3%) apresentaram na necrópsia lesões sugestivas de tuberculose. Os órgãos afetados foram o fígado, linfonodo submandibular, intestino, pulmão, linfonodo mediastino e glândula mamária. Foram isoladas micobactérias de sete (12,3%) animais e a tipificação genética pelo método de PRA demonstrou cinco (71,42%) infectados pelo Mycobacterium flavescens 1, um (14,28%) pelo M. kansasi, e um (14,28%) por micobactéria pertencente ao Complexo M. tuberculosis. Exames bacteriológicos para outras bactérias e/ou fungos isolaram Corynebacterium pseudotuberculosis em quatro (7,01%) dos 57 animais abatidos. Houve isolamento simultâneo de micobactérias e de Corynebacterium pseudotuberculosis em dois (3,5%) dos 57 animais abatidos. Os exames histopatológicos apontaram em nove (15,78%) animais a presença de granuloma e coloração de Ziehl-Neelsen positivo. A análise dos resultados obtidos permitiram concluir que, neste trabalho, os testes imunoalérgicos (Teste Cervical Simples e Teste Cervical Comparativo) não foram capazes de diferenciar infecção provocada pelo M. flavescens 1, M. kansasi, complexo M. tuberculosis e C. pseudotuberculosis. Nos exames macroscópico e histopatológico lesões provocadas por M. flavescens 1, M. kansasi, e C. pseudotuberculosis não foram diferenciáveis das provocadas pelo complexo M. tuberculosis. / The occurrence of few data on ovine (Ovis aries) tuberculosis and mycobacteriosis has motivated this work of isolation and typing microorganism found in lymph nodes and tuberculosis-like gross lesions. Tuberculin skin test was performed in 353 Santa Ines and Texel ovine breeds of two properties located at Pindamonhangaba Municipality - Sao Paulo State. Fifty seven animals were selected to be slaughtered and 31 of them had the bovine PPD skin test higher than avian PPD and other 26 presented bovine PPD reaction lower than avian PPD. Eleven animals (19.3%) showed tuberculosis-like gross lesions at necropsy. Most affected organs were liver, submandibular lymph nodes, intestines, lungs, mediastinic lymph nodes and mammary gland. It was possible to isolate mycobacteria from seven (12.3%) animals and genetic typing by the PRA method showed that five animals (71.42%) were infected with Mycobacterium flavescens 1, one (14.28%) with M. kansasi, and one (14.28%) with M. tuberculosis complex mycobacteria. Bacteriological culture isolation for other bacteria and/or fungi were positive for Corynebacterium pseudotuberculosis in four (7.01%) of 57 slaughtered animals. There was a concomitant isolation of mycobacteria and Corynebacterium pseudotuberculosis in two (3.5%) of 57 slaughtered animals. Histopathologic examination demonstrated the presence of granuloma and positive Ziehl-Neelsen staining in nine (15.78%) animals. Results analysis allowed concluding that in this work, immuno-allergic tests (Simple Cervical Test and Comparative Cervical Test) were not capable to differentiate infection caused by M. flavescens 1, M. kansasi, M. tuberculosis complex and C. pseudotuberculosis. During gross examination and histopathology, lesions caused by M. flavescens 1, M. kansasi, and C. pseudotuberculosis were not distinguishable from those caused by M. tuberculosis complex.

Corynebacterium pseudotuberculosis is a pathogenic bacterium which cause suppurative infection mainly in sheep, goats, horses, and other species. It plays a major role in the economy of sheep production worldwide. It produces a toxic phospholipase D which may be involved in pathogenesis. The relationship of physiologic differences between the two biovars of the organism to rates of growth and toxin production are not known. In this work, isolates of C.pseudotuberculosis were examined for relative ability to grow in brain heart infusion broth and a semidefined medium. The effects of carbohydrate source and the presence or absence of various ions were also examined. Results revealed no statistically significant differences between isolates or biovars in any characteristic studied, including growth rate, pH change during growth and PLD production. The semidefined medium provides a reasonable alternative to more complex media for further work in purification of PLD and study of its structure and function.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Corynebacterium pseudotuberculosis es el microorganismo causante de la linfoadenitis caseosa en pequeños rumiantes, así como de la linfangitis ulcerativa y abscesos en equinos y bovinos, causando pérdidas económicas importantes ya que disminuye el rendimiento productivo del ganado. Uno de los principales factores de virulencia de esta bacteria es la presencia de una esfingomielinasa específica, la fosfolipasa D, que favorece la diseminación de la bacteria dentro del hospedero. En este estudio se determina la presencia del gen que codifica esta exotoxina y se cuantifica la capacidad hemolítica de la misma, en aislados de C. pseudotuberculosis obtenidos desde ovinos, caprinos y equinos. Como resultado se obtuvo que existen diferencias dependiendo del origen, lo que puede estar generando las características de expresión de la enfermedad, ya que las cepas de origen ovino tienen mayor capacidad hemolítica que las de otras especies. Se sugiere que la capacidad hemolítica de las diferentes cepas puede estar relacionada con presentaciones clínicas diferentes en las especies animales en estudio y se propone un método de medición cualitativa de hemólisis en placas de agar sangre

The objective of this thesis was to better understand the epidemiology of caseous lymphadenitis (CLA) and its economic effects on the Australian sheep industries. The work also sought to apply this knowledge to better understand how to control the disease in Australian sheep flocks. The occurrence of CLA in some other species, as a comparison to CLA in sheep, is described in the literature review. However a comprehensive review of research on CLA in all livestock species is not needed to meet the aims of the thesis. The research used serological tests developed in the 1970s and ‘80s to examine the epidemiology and costs of CLA in Western Australian sheep flocks. Epidemiological techniques were used to determine the main risk factors associated with high incidences of CLA. Controlled experimentation was used to better understand the spread of CLA within flocks. Prevalence data collected at abattoirs and survey techniques were employed to better understand how CLA was being controlled in Australian sheep flocks. It was shown that toxin and cell wall ELISA tests for CLA were useful tools to study the spread of CLA in sheep flocks. Using the serological tests it was estimated that 80 per cent of CLA spread occurs after the second and third shearings. This knowledge was used to design a risk factor study which identified two significant factors associated with high CLA spread, that is in dips and close contact after shearing. These tests also facilitated the study of new CLA infection on wool production. It was found that sheep produce approximately five per cent less clean wool in the year in which they are infected. The main routes for the spread of CLA were from sheep with lung abscesses to those with skin cuts and through dips, rather than from an environment contaminated with Corynebacterium pseudotuberculosis bacteria. A survey of sheep producers found that the prevalence of CLA had decreased from over 50% in the 1970s to approximately 20% in the late 1990s. It also found that current vaccines were being used inefficiently. Large increases in the efficiency of control can be achieved by approximately 70 per cent of producers by using commercially available vaccines and the recommended vaccination programs of two

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-07-12T16:42:07Z No. of bitstreams: 1 Tese _ICS_Ricardo Evangelista Fraga.pdf: 5154897 bytes, checksum: af2af2c3bb0b0542ad0b616f2fd0beb9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-12T16:42:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese _ICS_Ricardo Evangelista Fraga.pdf: 5154897 bytes, checksum: af2af2c3bb0b0542ad0b616f2fd0beb9 (MD5) / O presente trabalho trata de estudos relacionados à Corynebacterium pseudotuberculosis (Cp), agente etiológico da linfadenite caseosa. Tem como finalidade estabelecer o perfil da resposta imune durante o percurso da infecção por estirpe atenuada (T1), relacionado ao primeiro experimento, ou selvagem (C57), segundo experimento, de Cp, em diferentes linhagens de camundongos, e desta forma estabelecer o padrão de resposta imune em animais susceptíveis e resistentes, além de avaliar o envolvimento do óxido nítrico, INF-gama e da citocina IL-10 no início do processo infeccioso. Uma comparação entre as respostas imunes a estas duas estirpes foi feita no terceiro experimento. Na metodologia empregada, para o primeiro e segundo experimento, foram utilizados 133 animais de diferentes linhagens, por experimento, sendo: de linhagem heterogênea - 28 Swiss; de linhagem isogênica - 28 Balb/c, 35 C57Black/6 selvagem, 14 C57Black/6 knockout (KO) para óxido nítrico (ON), 14 C57Black/6-KO-IFN-gama e 14 C57Black/6 knockout-KO-IL-10. Cada linhagem estudada foi dividida em dois grupos (controle e teste). Para o terceiro experimento foram utilizados 15 animais Balb/c divididos em três grupos. Os animais do grupo teste foram infectados com a estirpe T1 com 107/ml (1° experimento), a C57 com 102/ml (2° experimento) ou 104/ml das duas estirpes (T1 ou C57), no 3° experimento. Após a infecção os animais Swiss, Balb/c e C57Black/6 selvagens, foram avaliados aos 07, 30, 60 e 120 dias, enquanto que os animais C57Black/6 selvagens e knockout, foram analisados aos 07 e 14 dias (1° e 2° experimentos). Os animais referentes ao 3° experimento foram avaliados aos 70 dias após a infecção. Foi realizada a construção da curva de mortalidade; avaliação morfológica, que constava da identificação de granulomas, bem como dos locais de acometimento e avaliação do peso do baço; avaliação do direcionamento celular para o local da infecção, que corresponde a avaliação total e diferencial das células da cavidade peritoneal; produção das citocinas IL-1α, TNF-α, INF-γ, GMC-SF, IL-10, IL-6, IL-2, IL-17 por células aderentes da cavidade peritoneal estimuladas com antígenos secretados ou com bactéria viva (1° e 2° experimento); imunofenotipagem, avaliando as células T CD4+ e T CD8+; bem como a mensuração das citocinas IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IL-21, IL-22, IL-27, INF-γ e TNF-α no homogenato do baço, em todos os experimentos. Os resultados obtidos mostram uma diferença entre as linhagens Balb/c, C57Black/6 e Swiss no tipo de resposta imune estabelecida durante infecção com T1 e com C57, onde os animais C57Black/6 demonstraram ser mais resistentes. Dentre os animais nocauteados, aqueles KO-IL-10 demonstraram ser mais resistentes, enquanto que os animais KO-ON e KO-INF-γ foram mais sensíveis à infecção. No 3° experimento foi possível visualizar que a estirpe C57 induziu alterações morfológicas mais acentuadas e maior direcionamento de células para o local da infecção, quando comparada com tais induções feitas pela estirpe T1. Com os experimentos realizados e resultados obtidos, pretendeu-se fornecer subsídios para uma melhor compreensão da relação parasito-hospedeiro no modelo murino, em infecções experimentais que confrontam duas estirpes desta bactéria com diferentes linhagens de camundongos. Estes conhecimentos poderão orientar a construção de protocolos de imunização/desafio visando o desenvolvimento de vacinas ou/e imunoterapias. / Salvador

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-08-14T20:09:15Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Miriam Flores.pdf: 1077091 bytes, checksum: b0adcded73dce2647872382d21f4a4be (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-14T20:09:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Miriam Flores.pdf: 1077091 bytes, checksum: b0adcded73dce2647872382d21f4a4be (MD5) / FAPEX;CNPq / Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiologic agent of caseous lymphadenitis (CLA), a chronic disease that affects goats and sheep, characterized by granuloma formation in subcutaneous and internal lymph nodes. CLA causes significant economic losses in commercial goat herds; the best procedure to avoid spread of this disease is elimination of infected animals. Secreted antigens from T1 strain bacteria grown in brain heart infusion (BHI) broth were tested in an indirect ELISA system to determine if this system could be used to identify specific immunoglobulins against C. pseudotuberculosis. The electrophoretic profile of the BHI antigen was analyzed, as well as the recognition pattern by CLA infected sheep sera. The ELISA results were compared to Multiplex PCR assay and IFN-gamma production. The ELISA was able to discriminate between negative and positive animals, with a sensitivity of 89% and a specificity of 99%, and a large difference between positive and negative optical density values. When this assay was compared with other immunological and molecular methods, it was found only two discrepant results among thirty-two samples. We concluded that an ELISA using secreted antigens from C. pseudotuberculosis T1 strain growth in BHI broth culture would be a reliable tool for the serodiagnosis of caseous ymphadenitis in sheep. / Salvador

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2016-10-26T12:28:06Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Igor.pdf: 1540006 bytes, checksum: 333c9da080a2bb906e1bfea7082e9aae (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-26T12:28:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Igor.pdf: 1540006 bytes, checksum: 333c9da080a2bb906e1bfea7082e9aae (MD5) / A linfadenite caseosa, causada por Corynebacterium pseudotuberculosis (C.p) é considerada uma doença crônica que acomete caprinos e ovinos, causando perdas econômicas graves no Nordeste do Brasil. Neste trabalho buscou-se avaliar aspectos da resposta imunológica de camundongos BALB/c durante a infecção com duas diferentes linhagens de Corynebacterium pseudotuberculosis (T1 e C57) que apresentam graus de virulência diferentes: a cepa T1 caracteriza-se por apresentar infecções mais brandas, ao passo que a C57 um comprometimento maior dos animais infectados. A infecção experimental de camundongos reproduz os principais aspectos observados em caprinos e ovinos. Para este experimento foram utilizados 15 camundongos da linhagem BALB/c subdivididos em três grupos: grupo controle (n=5), grupo infectado com 104/ml da linhagem T1(n=5) e um grupo infectado com 104/ml da linhagem C57(n=5). Após 70 dias de infecção esses animais foram eutanasiados. Realizou-se também a avaliação morfológica (presença de granulomas e peso do baço). A resposta imune inata foi avaliada através do padrão de migração celular para a cavidade peritoneal, através da quantificação total e diferencial de células presentes nesta cavidade. A avaliação da resposta imune adaptativa foi realizada através da mensuração da população de linfócitos TCD4+ e TCD8+ presentes no baço de cada camundongo BALB/c, através da imunofenotipagem por citometria de fluxo, bem como a mensuração das citocinas IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IL-21, IL-22, IL-27, INF-γ e TNF-α no homogenato do baço. A linhagem C57 induziu alterações morfológicas (presença de granulomas e peso do baço) mais acentuadas, que a linhagem T1. Foi possível também identificar que durante a infecção com a linhagem C57 ocorreu um maior direcionamento celular para o local da infecção e um aumento dos linfócitos TCD4+ e TCD8+. Observou-se também que as citocinas do perfil inflamatório IL-1 alfa e IL-6 e regulatório IL-13 e IL-10 apresentaram diferença significativa, demonstrando um aumento no grupo dos animais infectados com a linhagem T1. As citocinas TNF-α e IL-17 são difíceis de serem padronizadas, uma vez que não foi observado a produção detectável destas citocinas. As citocinas IL-2, IL-4, INF-γ, IL-22, IL-21 e IL- 27 não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. Pode-se concluir que diferentes linhagens de C.pseudotuberculosis (T1 e C57) podem apresentar graus de virulência diferentes, que por sua vez, podem interferir no processo de estabelecimento da doença. Os resultados encontrados contribuem para uma melhor compreensão do tipo de resposta e dos mecanismos imunológicos envolvidos durante a infecção com diferentes linhagens de C. pseudotuberculosis.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-08-13T16:46:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Heidiane Alves dos Santos.pdf: 1654611 bytes, checksum: d1c1496a80a371c6d05868103f946b63 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-13T16:46:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Heidiane Alves dos Santos.pdf: 1654611 bytes, checksum: d1c1496a80a371c6d05868103f946b63 (MD5) / A linfadenite caseosa é uma doença infecto-contagiosa crônica, de ocorrência mundial que acomete pequenos ruminantes, causando grandes perdas econômicas. Esta doença tem como agente etiológico a bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis e caracteriza-se pela formação de granulomas em gânglios linfáticos superficiais, podendo também acometer órgãos e linfonodos internos, como forma de resposta do sistema imune do hospedeiro à penetração deste agente que resiste a ação bactericida das células fagóciticas. Este patógeno se relaciona filogeneticamente ao Mycobacterium tuberculosis. A avaliação da resposta imune é uma importante ferramenta para localização de animais possivelmente infectados, dificultando desta forma a disseminação do agente. Estudos têm demonstrado a importância de citocinas na defesa de patógenos intracelulares facultativos, inclusive para C. pseudotuberculosis, destacando-se o interferon-gama (IFN-) citocina característica de células Th1, que pode está envolvida na proteção à patógenos intracelulares. O presente estudo avaliou aspectos da resposta imunológica de camundongos da linhagem C57Black/6 selvagem e knockout para IFN-gama, durante a infecção por Corynebacterium pseudotuberculosis. Os grupos foram acompanhados ao longo de 7 e 14 dias após infecção intraperitoneal com 107 UFC, durante os quais foram avaliados a disseminação bacteriana, a frequência de granulomas, a variação de peso do baço, o padrão de migração celular para a cavidade peritoneal, além da resposta imune humoral através da dosagem de IgG e subclasses e resposta imune celular através da dosagem de citocinas e imunofenotipagem. Os camundongos knockout para IFN-gama se mostraram mais susceptíveis à infecção por Corynebacterium pseudotuberculosis apresentando maior disseminação bacteriana nos linfonodos mesentéricos, maior frequência de granulomas, aumento considerável no peso do baço, intensa migração celular para a cavidade peritoneal, principalmente neutrófilos e macrófagos e expressão de linfócitos T CD8+ nas células esplênicas, e consequentemente menor expressão de citocinas pró-inflamatórias e regulatórias. Estes achados apontam para a importância do IFN-γ na resposta imune a patógenos intracelulares a exemplo de C. pseudotuberculosis, ao tempo em que demonstra a resposta deficiente do sistema imune dos animais nocauteados à infecção. / Salvador