Les cotransporteurs K⁺-C1⁻ (KCCs) sont des protéines membranaires appartenant à la famille des cotransporteurs cation-C1⁻ (CCC). Leur activité de transport est sensible au NEM, un agent alkylant qui modifie les groupements sulfhydriles accessibles, et leur extrémité C-terminale interagit avec celle d'autres CCCs pour aider à la formation de structures oligomériques. Ces caractéristiques suggèrent que certains résidus cysteines dans les KCCs participent à la fonction et à l'assemblage du transporteur. Dans ce travail, nous avons exploité une approche mutagénique par laquelle l'isoforme neuronal KCC2 a été utilisé comme modèle pour identifier les résidus en cause et la nature de leur implication. Chacun des mutants étudiés renfermait une substitution C G unique dans ses extrémités, lesquelles incluent les domaines d'interaction CCCs/CCCs, sont exposées aux voies si-gnalétiques et baignent dans le milieu réducteur du cytosol, et les types cellulaires utilisés pour l'expression comprenaient les oocytes de la xénope ainsi que les cellules HEK-293. Nous avons observé que les activités de transport pour deux des mutants (C854G et C982G) étaient toujours inhibés par le furosémide, un diurétique de l'anse, mais différaient par rapport au sauvage dans certaines conditions, et étaient plus sensibles à l'effet inhibiteur du NEM. Pendant que, de façon intéressante, les activités de transport pour les différents KCC2 ne semblaient pas corréler avec l'expression à la surface, elles semblaient toutefois corréler avec la formation homooligomérique selon des études de coim-munoprécipitation, et en présence de NEM, le KCC2 sauvage était moins mobile dans les membranes. De façon combinée, ces résultats suggèrent que les résidus cysteines 854 et 982 jouent un rôle fonctionnel important, en supportant des interactions pertinentes entre les KCCs eux-mêmes ou entre les KCCs et d'autres partenaires.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 139-161. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Le cotransporteur K+-Cl− de type 3 (KCC3) est un transporteur d’ions qui fait partie de la famille des cotransporteurs cation-Cl− et qui serait impliqué dans la régulation de la pression artérielle (PA). Pour comprendre comment il accomplit son rôle, nous avons procédé à la caractérisation détaillée du phénotype cardiovasculaire d’un modèle murin Kcc3−/−. Nous avons observé que ce modèle se distinguait de la souris type sauvage par une PA pulsée et une fréquence cardiaque plus basses, une PA diastolique plus élevée, une aorte isolée moins réactive à la stimulation adrénergique, une masse ventriculaire augmentée, une aldostéronémie plus élevée sans suppression de la rénine et divers troubles neurologiques. Ces données suggèrent que les désordres hémodynamiques chez la souris Kcc3−/− sont causés en partie par l’absence de KCC3 dans la paroi de différents types de vaisseaux, ce qui entraînerait une augmentation de la résistance vasculaire périphérique et de la distensibilité aortique. / The K+-Cl− cotransporter type 3 (KCC3) is an ion transporter that belongs to the cation-Cl− cotransporter family and that probably plays an important role in blood pressure (BP) regulation. To determine how it accomplishes this role more specifically, we have characterized the cardiovascular phenotype of a Kcc3−/− mouse model through detailed analyses. We have found that this model distinguished itself from the wild-type animals by lower pulse pressure and heart rate, higher diastolic BP, lower in vitro reactivity of their aorta to adrenergic stimulation, higher ventricular mass, higher aldosterone levels in the absence of renin suppression and various neurologic abnormalities. These observations suggest that the hemodynamic disorders identified in the Kcc3−/− mouse model are due in part to the absence of KCC3 in the wall of different vessel types, leading to higher peripheral vascular resistance and aortic distensibility.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Reproduction de : Thèse de doctorat : cMicrobiologie et biocatalyse industrielles : Toulouse, INPT : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 236 réf.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le cotransporteur Na⁺-K⁺-Cl⁻ de type 2 (NKCC2) appartient à la famille des cotransporteurs cation-Cl⁻ (CCC). Il existe en tant que trois variants d'épissage, appelés A, B et F, qui ne diffèrent entre eux que de 32 acides aminés et qui sont tous localisés sur la membrane apicale de l'anse ascendante de Henle (AAH) à l'état homodimérique. Ils sont cependant exprimés de façon différentielle : NKCC2F se retrouve à la partie initiale de l'AAH où il assure une réabsorption importante du NaCl pour le maintien du volume extracellulaire alors que NKCC2A et NKCC2B se retrouvent à la partie distale de l'AAH et dans la macula densa où ils assurent une réabsorption plus modeste du NaCl pour aider au maintien du volume extracellulaire et soutenir la rétroaction tubuloglomérulaire. Comme « A » et « B » se retrouvent dans des types cellulaires communs, nous nous sommes demandé : 1) s'ils pouvaient former des hétérodimères AB dont les caractéristiques de transport ionique différaient de AA et BB et 2) si les quantités relatives de AA, AB et BB pouvaient être régulés pour permettre à l'AAH distale et à la macula densa d'opérer adéquatement à l'intérieur d'un éventail de concentrations ioniques plus large. L'objectif de recherche a donc été de générer des constructions d'ADNc où deux variants sont connectés entre eux par un « linker » inerte pour forcer la formation de dimères AA, AB ou BB, d'exprimer le produit de ces constructions dans des ovocytes de Xenopus laevis et d'en caractériser la cinétique de transport. Nous avons trouvé que des hétérodimères déployaient des caractéristiques fonctionnelles uniques (différentes par rapport à AA ou BB). Les vitesses maximales de transport atteintes par l'hétérodimère AB étaient beaucoup plus élevées que les homodimères AA et BB. Nos données suggèrent ainsi que les sous-unités assemblées coopèrent entre elles durant le processus de transport. Nos données ouvrent aussi la voie sur la possibilité que la quantité d'hétérodimères formés puisse être régulée de manière à permettre un spectre de réponses en fonction des besoins à combler. / The Na⁺-K⁺-Cl⁻ cotransporter type 2 (NKCC2) belongs to the cation-Cl⁻ cotransporter (CCC) family. It exists as three splice variants called A, B and F that differ among each other by 32 residues and that are all localized on the apical membrane of the thick ascending loop of Henle (TALH) as homodimers. However, they are differentially distributed along this nephron segment: NKCC2F is localized in the initial part of the TALH where it ensures substantial NaCl reabsorption to maintain the extracellular fluid volume and NKCC2A and NKCC2B are localized in the distal part of the TALH where it ensure more modest NaCl reabsorption to help in the maintenance of the extracellular fluid volume and support the tubuloglomerular feedback. As "A" and "B" are localized in the same cellular types, we asked ourselves: 1) whether they could form AB heterodimers with transport characteristics that differ from AA and BB and 2) whether the relative quantities of AA, AB and BB formed could be regulated to allow the distal TALH and macula densa to operate adequately within a wider range of ionic concentrations. My research objective was thus to generate cDNA constructs in which the A and/or B variants are connected to each other by an inert "linker" to force the formation of AA, AB or BB by proximity, to express the product of these cDNA constructs in Xenopus laevis oocytes and to characterize the transport kinetics of the NKCC2 produced. We found that AB heterodimers exhibited unique functional characteristics (relative to AA or BB). In particular, maximal transport rates were much higher for the AB heterodimers than for the AA and BB homodimers. Our data therefore suggest that the assembled subunits cooperate with each other during the transport cycle. Our data also pave the way towards the possibility that the quantity of AB heterodimers formed is regulated such that an array of responses are allowed as a function of the needs to be met.

L'activité des cotransporteurs K-Cl (KCC1 à 4) est modulée par des changements de concentration en Cl ([Cl]) et du volume cellulaire. Les voies signalétiques d'activation ou d'inhibition des KCCs impliquées suite à de tels changements sont encore inconnues. Selon plusieurs études effectuées avec des agents pharmacologiques, le cotransport K-Cl serait activé par déphosphorylation des transporteurs et vice versa. Toutefois les enzymes régulatrices et les domaines KCCs avec lesquels elles interagissent ne sont pas encore élucidés quoiqu'il ait été rapporté que le C-terminus (Ct) de ces transporteurs semble jouer un rôle fonctionnel important à cet égard. D'autre part, nous avons récemment trouvé que l'activité de KCC2 et KCC4 est inhibée par le 4p-phorbol 12-myristate 13-acetate ou PMA, suggérant une régulation par la protéine kinase C (PKC). Les objectifs de cette thèse étaient donc d'analyser le rôle du Ct dans la régulation des KCCs en réponse aux changements de tonicité ou de [Cl] et au PMA, d'identifier des sites potentiels de phosphorylation par la PKC dans la structure des KCCs et de faire des études in vitro pour vérifier si les changements de tonicité ou de [Cl] et si l'effet du PMA s'accompagnent de changements dans le degré de phosphorylation des KCCs. L'approche privilégiée a été de générer des protéines chimériques KCC2-KCC4 dans lesquelles j'ai échangé 3 domaines du Ct (proximal, central et distal) et des mutants ponctuels dans lesquels j'ai supprimé les sites potentiels de PKC dans les domaines cytsoliques de ces transporteurs, et de déterminer l'impact de ces changements sur l'activité des transporteurs et leurs niveaux de phosphorylation. Plus spécifiquement, les protéines modifiées (n =19) et sauvages (n = 2) ont été exprimées dans les oocytes du xénope et l'activité de transport a été déterminée en mesurant l'influx en 86Rb et les niveaux de phosphorylation ont été analysés avec du H332PÛ4 par autoradiographie et ce, dans différentes conditions (mentionnées ci-dessus). Mes travaux ont permis de démontrer pour la première fois que la configuration structurale adoptée par le Ct des KCCs joue un rôle clé dans la régulation de ces protéines en réponse au gonflement cellulaire ou à l'augmentation de l'activité PKC membranaire mais que ces changements sont en partie indépendants de l'état de phosphorylation des transporteurs. Ils ont permis également de démontrer de nouveaux mécanismes de régulation des KCCs bien distincts suite à des changements de volume cellulaire, un mécanisme indépendant de la phosphorylation qui permettrait d'activer le cotransport K-Cl suite au gonflement cellulaire et un mécanisme dépendant de la phosphorylation qui permettrait de supprimer le cotransport K-Cl suite au rétrécissement cellulaire.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 66-70. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

L'hippocampe est l'endroit central où s'élaborent les processus de mémorisation et d'apprentissage. C'est aussi le siège de plusieurs maladies dégénératives telles que Pépilepsie, l'ischémie et autres désordres psychiatriques. Le récepteur ionotropique GABAA et le co-transporteur KCC2 sont des composants complexes qui résident dans les synapses GABAergiques de l'hippocampe. Leur fonctionnement est régi par une relation de coopération dynamique assurée par des échanges ioniques. Les ions chlorure jouent un rôle prépondérant et leur distribution hétérogène serait un indicateur d'anomalie : pathologie ou trouble de mémorisation. Dans le cadre de cette maîtrise, nous proposons un travail portant sur la modélisation du comportement diffusif des ions chlorure géré par l'action coopérative GABAA et KCC2. Dans une première partie nous présenterons une revue bibliographique sur les fondements de neurobiologie. Nous développerons particulièrement les aspects touchant les phénomènes de connectivité des neurones, de localisation et de structure des différents récepteurs et canaux ioniques. Dans la deuxième partie, nous démontrerons les principes fondamentaux des phénomènes de diffusion. Nous nous limiterons aux cas essentiels de la diffusion macroscopique avec ou sans force externe et à la théorie de la marche aléatoire. Un chapitre sera consacré aux éléments finis, méthode de résolution des équations différentielles partielles, et code Femlab utilisés pour représenter la dynamique des mouvements intermembranaires des ions chlorures. Nous mettrons l'accent sur les exigences et les pièges à éviter pour obtenir un modèle stable et près de la réalité de l'objet. Finalement, nous donnerons les résultats obtenus en modélisation et en simulation. / The hippocampus is the central place where the processes of memorizing and training are worked out. It is also the seat of several degenerative diseases such as the psychiatric disorders, epilepsy and ischaemia. The ligand-gated channel GABAA and the KCC2 cotransporter are complex components which reside in GABAergics synapses of the hippocampus. Their operation is governed by a dynamic relation of co-operation ensured by ionic exchanges. The chloride ions play a dominating part and their heterogeneous distribution would be an indicator of anomaly: pathology or disorder of memorizing. Within the framework of this control, we propose a bearing work on the modeling pf the diffusive behavior of the chloride ions managed by the co-operative action of GABAA and KCC2. In a first part we will present a bibliographical review on the bases of neurobiology. Wc will particularly develop the aspects concerning the phenomena of connectivity of the neurons, localization and structure of the various ionic channels. In the second part, we will show the fundamental principles of the phenomena of diffusion. We will limit ourselves to the essential cases of the macroscopic diffusion with or without external force and to the theory of random walk. A chapter will be devoted to the finite elements, a method of resolution of partial differential equations, and Femlab codes used to represent the dynamics of the intermembrane movements of chloride ions. We will stress the requirements and the traps to avoid to obtain a stable model and close to the reality of the object. Finally, we will give the results obtained in modeling and simulation.