Les récentes avancées en microscopie de fluorescence (augmentation de résolution spatiale, correction des aberrations induites par l'échantillon...) ouvrent de nombreuses perspectives en imagerie biologique. Mais pour que ces techniques se répandent, il est nécessaire de réduire les contraintes qu'elles imposent sur la préparation des échantillons, sur les sondes fluorescentes, sur la complexité de mise en oeuvre ou la cadence d'acquisition. Pendant ma thèse, j'ai travaillé sur le développement et l'amélioration de quelques-unes de ces techniques. Dans un premier temps, deux systèmes d'illumination structurée ont été réalisés dans le but d'accélérer la cadence de réalisation de coupes optiques pour l'observation d'échantillons épais vivants. Une deuxième partie de mon travail a concerné la mise en place d'une nouvelle approche de reconstruction en illumination structurée afin de dépasser la limite de résolution imposée par le microscope. Cet outil permet de réduire le nombre d'images requises pour la reconstruction d'une image super-résolue, ce qui ouvre la voie à une augmentation de la cadence de réalisation de ces images. Un montage d'optique adaptative a également été développé afin de corriger les aberrations introduites par les échantillons épais, permettant une amélioration des capacités d'imagerie en profondeur. L'accent a été mis sur la protection de l'échantillon, grâce à l'utilisation de billes fluorescentes pour déterminer la correction à appliquer sans illuminer l'échantillon. Enfin, un instrument de mesure du rendement quantique de fluorescence dédié à la caractérisation de fluorophores infrarouges a été mis en oeuvre afin de pallier les limitations des méthodes de mesure classiques dans le proche infrarouge.