Le développement des senseurs protéiques et des outils optogénétiques au cours des dernières années a donné une place particulière à la microscopie pour l’étude des processus moléculaires in-vivo. L’équipe « Nano-optique et physiologie intégrée » développe des montages optiques originaux pour exploiter ces nouveaux outils chez le petit animal vivant en collaboration avec des neurobiologistes. Nous nous intéressons en particulier à l’organisation cellulaire et à l’activité des réseaux neuronaux impliqués dans la mémorisation associative olfactive de la drosophile. En amont, mon travail de thèse a été de mettre en place un microscope grand champ, basé sur le principe de la microscopie à HiLo, permettant l’acquisition rapide de sections optiques et la reconstruction tridimensionnelle de réseaux neuronaux. Après avoir prouvé la pertinence de l’approche choisie lorsqu’elle est associée aux outils génétiques permettant un marquage sélectif des neurones, le cœur de mon travail fut le développement d’un montage original permettant d’atteindre les objectifs de résolution spatiale et de vitesse. Son originalité se situe dans l’utilisation de la technologie des matrices de micro-miroirs (DLP) pour structurer l’illumination. Ce système de micro-miroirs pilotables peut moduler le faisceau d’une source LED haute puissance à haute cadence. Dans une seconde partie, j’ai caractérisé ce microscope et réalisé de premières expériences in-vivo avec les développements spécifiques nécessaires à ces expériences. En particulier, en utilisant un rapporteur protéique calcique fluorescent, GCamP3, j’ai montré que l’on pouvait suivre, dans des régions ciblées du cerveau, la réponse à des stimulations physiologiques à cadence vidéo. / In the last decades, optogenetic and protein reporter development have given a special place to optical microscopy for in-vivo investigation of biological molecular processes. Our team, “Nano-optics and integrated physiology”, develops optical set-ups to take advantage of these tools on small living animals, in collaboration with neurobiologists. We are particularly interested both in the cellular organization and neural activity involved in the olfactory memory formation in drosophila. Upstream to these investigations, my PhD research aimed at developing a new implementation for wide-field microscopy based on the HiLo concept. The new design took advantage of the micro-mirror array technology (DLP) to structure the illumination. This system can modulate the beam made by a high power LED illumination with high acquisition rates. I characterized this microscope and realized preliminary in-vivo experiments with specific developments made for physiological experiments under the microscope. Thus, I demonstrated both high spatial resolution imaging and a tenfold increase of speed with respect to confocal microscopy. I reached acquisition rates compatible with 3D monitoring of specific neural networks.

Ce travail de thèse visait à concevoir, assembler, optimiser et tester des modules d’illumination structurée à base d’éléments optiques diffractifs (EODs) pour une application de reconnaissance faciale sur appareils mobiles (smartphones, tablettes). L’intégration des modules dans des smartphones impliquait de fortes contraintes de miniaturisation, de consommation énergétique, de coût, et de sécurité laser. L’élément clé de chaque module était un EOD de Fourier à angle de diffraction supérieur à la limite du modèle scalaire paraxial de la diffraction permettant d’illuminer la surface d’un visage à une distance d’une portée de bras. Afin de faciliter la conception (relâchement des contraintes angulaires), la fabrication (minimisation de l’efficacité de diffraction à l’ordre 0) et la réplication des EODs, le premier axe de travail a consisté à concevoir et à fabriquer des dispositifs hybrides « agrandisseurs d’angles » combinant des EODs et des optiques divergentes conventionnelles. Le second volet portait sur la conception des EODs qui devait prendre en considération à la fois les paramètres des systèmes bas coût d’illumination et d’acquisition d’images utilisés, notamment pour contrôler la présence de granularité laser (« speckle ») sur la figure de diffraction souhaitée (contrôle imposé par les algorithmes de reconnaissance faciale et de détection de fraudes utilisés). Le savoir-faire acquis dans le domaine de l’illumination structurée générée par des EODs a été étendu et transposé à trois autres applications dans les domaines de la vibrométrie, de l’aviation civile et commerciale, et de l’aviation militaire. / This thesis work aimed to design, assemble, optimize and test structured illumination modules based on diffractive optical elements (DOEs) for facial recognition application on mobile devices (smartphones, tablets). The integration of modules into smartphones involved significant constraints in terms of miniaturization, energy consumption, cost and laser safety. The key element of each module was a Fourier DOE with a diffraction angle greater than the limit of the paraxial scalar diffraction model to illuminate the surface of a face at a distance of an arm reach. In order to facilitate the design (relaxation of angular constraints), manufacturing (minimization of the zero order diffraction efficiency) and replication of DOEs, the first axis of research consisted in designing and manufacturing hybrid "angle enlarger" devices combining DOEs and conventional divergent optics. The second part concerned the design of the DOEs, which had to take into account both the parameters of the low-cost illumination and image acquisition systems used, in particular to control the presence of laser speckle on the desired diffraction pattern (control imposed by the facial recognition and fraud detection algorithms used). The know-how acquired in the field of structured illumination generated by DOEs has been extended and transposed to three other applications in the fields of vibrometry, civil and commercial aviation, and military aviation.

Les récentes avancées en microscopie de fluorescence (augmentation de résolution spatiale, correction des aberrations induites par l'échantillon...) ouvrent de nombreuses perspectives en imagerie biologique. Mais pour que ces techniques se répandent, il est nécessaire de réduire les contraintes qu'elles imposent sur la préparation des échantillons, sur les sondes fluorescentes, sur la complexité de mise en oeuvre ou la cadence d'acquisition. Pendant ma thèse, j'ai travaillé sur le développement et l'amélioration de quelques-unes de ces techniques. Dans un premier temps, deux systèmes d'illumination structurée ont été réalisés dans le but d'accélérer la cadence de réalisation de coupes optiques pour l'observation d'échantillons épais vivants. Une deuxième partie de mon travail a concerné la mise en place d'une nouvelle approche de reconstruction en illumination structurée afin de dépasser la limite de résolution imposée par le microscope. Cet outil permet de réduire le nombre d'images requises pour la reconstruction d'une image super-résolue, ce qui ouvre la voie à une augmentation de la cadence de réalisation de ces images. Un montage d'optique adaptative a également été développé afin de corriger les aberrations introduites par les échantillons épais, permettant une amélioration des capacités d'imagerie en profondeur. L'accent a été mis sur la protection de l'échantillon, grâce à l'utilisation de billes fluorescentes pour déterminer la correction à appliquer sans illuminer l'échantillon. Enfin, un instrument de mesure du rendement quantique de fluorescence dédié à la caractérisation de fluorophores infrarouges a été mis en oeuvre afin de pallier les limitations des méthodes de mesure classiques dans le proche infrarouge.

L’utilisation de techniques de microscopie optique de plus en plus performantes a permis des avancées considérables en neurobiologie. Néanmoins, la population de neurones mise en jeu lors de la formation de la mémoire, ainsi que sa dynamique restent à ce jour très peu connues. L’objectif de la thèse est de développer puis d’utiliser deux types de microscopies originales couplées à des sondes fluorescentes de dernière génération (sondes calciques G-CaMP6f et sonde voltage ArcLight) pour l’étude in vivo des réseaux neuronaux impliqués dans la mémorisation chez la drosophile. Le choix du modèle Drosophila melanogaster pour cette étude neurobiologique est justifié par plusieurs atouts uniques : un cerveau peu volumineux, des capacités d’apprentissage remarquables, la possibilité d’analyser un réseau neuronal dans sa globalité avec une résolution cellulaire et la disponibilité d’outils génétiques très perfectionnés pour son étude. Le premier type de microscopie conçu est celui dite à illumination structurée de type HiLo permettant d'obtenir une coupe optique en profondeur. Nous avons alors étudié le rôle de divers récepteurs, tels que les récepteurs dopaminergiques et gabaergiques dans la transmission de l'information punitive jusqu'aux neurones des corps pédonculés. Nous avons également mis en évidence une non-homogénéité spatiale des neurones de type α/β des corps pédonculés en termes d’excitation et d’inhibition en réponse à une stimulation punitive pour une profondeur d’analyse d'environ 10 à 20 µm. Cette profondeur limite étant imposée par les aberrations, nous avons alors implémenté une boucle d’optique adaptative dans notre microscope. Cela a permis de réaliser des analyses morphologiques jusqu’à 50 µm de profondeur. Le second type de microscopie développé est la microscopie multiconfocale de type « spinning disk » dans le but d’imager l’ensemble des corps cellulaires des neurones des corps pédonculés. Le développement de ce projet n'est pas achevé, ce qui n’a pas encore permis de répondre à des questions biologiques d’intérêt. / Cellular and neural network dynamics involved in memory formation remain poorly known despite the progress brought by advanced optical microscopies to neurobiology. The use of Drosophila melanogaster as a model organism constitute one of the most promising approaches due to its unique features: a small brain size, outstanding learning capabilities, very powerful genetic tools and the possibility to analyze a whole neural network with a cellular resolution. To this aim, we implemented two types of optical fluorescence microscopes coupled to cutting-edge fluorescent biosensors, calcic G-CaMP6f and voltage ArcLight probes. We used HiLo structured illumination, a technique able to provide axial optical sectioning, deep in the brain, to study the role of dopaminergic and gabaergic molecular receptors in the transmission of aversive stimulus to mushroom bodies neurons. We also evidenced a non-uniform response of type α/β mushroom bodies neurons under electrical stimulation at 10 to 20 µm depth of analysis. To penetrate deeper in the brain, we added an adaptive optics feedback loop into our microscope in order to overcome aberrations issues. We were then able to rebuild optical sections down to 50 µm depth. The second type of microscopy we developed is a multiconfocal microscope using spinning disk. The aim was to image all the mushroom bodies neurons, at the level of their cell bodies, with a cellular resolution. Since this project is at its beginning, it did not allow us to answer to advanced biological questions yet.

Cette thèse a pour objectif l’étude d’un lien effectif potentiel entre la motilité cellulaire, la mécanique cellulaire, et l’activité biochimique de ces mêmes cellules. Ce couplage a été étudié dans divers systèmes biologiques, et aussi bien dans des cultures de cellules qu’à l’intérieur de tissus plus complexes. Notamment, nous avons particulièrement cherché à détecter un couplage électromécanique dans des neurones qui pourrait être impliqué dans la propagation du message nerveux.Pour ce faire, nous avons dû développer deux microscopes optiques à la sensibilité extrême. Ces microscopes se composent de deux parties principales. La première sert à détecter des mouvements axiaux plus petits que la longueur d’onde optique, soit en dessous de 100 nanomètres. La deuxième partie permet la détection d’un signal de fluorescence, offrant la possibilité de suivre l’évolution biochimique de la cellule. Avec ces deux microscopes multimodaux, il est donc possible de suivre de manière simultanée un contraste de motilité, un contraste mécanique, un contraste structurel et un contraste biochimique. Si l’un de ces systèmes est basé sur la tomographie de cohérence optique plein champ et permet de faire de telles mesures en 3-D et en profondeur dans les tissus biologiques, le second ne permet que des mesures dans des cultures de cellules, mais est bien plus robuste au bruit mécanique. Dans ce manuscrit, nous allons essentiellement décrire le développement de ces deux appareils, et préciser les contrastes auxquels ils sont sensibles spécifiquement.Nous développerons également deux des applications principales de ces microscopes que nous avons étudié dans le détail au cours de cette thèse. La première application développe l’intérêt d’un de nos microscopes pour la détection sans marquage des principaux composants cellulaires et structuraux de la cornée et de la rétine. La seconde application tend à détecter et à suivre des ondes électromécaniques dans des neurones de mammifères / This PhD project aims to explore the relationship that might exist between the dynamic motility and mechanical behavior of different biological systems and their biochemical activity. In particular,we were interested in detecting the electromechanical coupling that may happen in active neurons, and may assist in the propagation of the action potential. With this goal in mind, we have developed two highly sensitive optical microscopes that combine one modality that detects sub-wavelength axial displacements using optical phase imaging and another modality that uses a fluorescence path. Therefore, these multimodal microscopes can combine a motility, a mechanical,a structural and a biochemical contrast at the same time. One of this system is based ona multimodal combination of full-field optical coherence tomography (FF-OCT) and allows the observation of such contrast inside thick and scattering biological tissues. The other setup provides a higher displacement sensitivity, but is limited to measurements in cell cultures. In this manuscript, we mainly discuss the development of both systems and describe the various contrastst hey can reveal. Finally, we have largely used our systems to investigate diverse functions of the eye and to look for electromechanical waves in cell cultures. The thorough description of both biological applications is also provided in the manuscript