A criptococose clinica foi observada por volta do primeiro dia da inoculação e a sobrevida dos animais 15 dias após-inoculação (PI). Isolamos C. neoformans no cérebro a partir do 5º dia (PI) e no pulmão a partir 11º dia (PI). No 1º dia (PI) observamos por meio do tecido cerebral que já havia um quadro inicial de infecção, presença de edema, que evoluiu durante todo o período. C. neoformans foi visualizado primeiramente nos vasos capilares, o que nos leva a sugerir que seja esta rota importante para a entrada da levedura no órgão. A meningite aguda aconteceu por volta do 7º dia quando visualizamos o microrganismo na meninge e com um discreto infiltrado inflamatório. A partir do 13º dia a doença evoluiu para crônica permanecendo até o óbito dos animais. A monoterapia com anfotericina B (AMB) reduziu a sobrevida dos animais, enquanto que, o tratamento isolado com fluconazol (FLC) prolongou a mesma. A associação AMB-FLC foi eficaz, quando iniciamos o tratamento 24 horas (PI), enquanto que, o mesmo tratamento iniciado a partir do 7º dia quando já tínhamos um quadro compatível de meningite aguda não foi satisfatório. É importante ressaltar que os resultados descritos foram referentes à inoculação com isolado sensível in vitro ao fluconazol, enquanto que, o tratamento não resultou em êxito quando empregamos isolado resistente in vitro ao fluconazol. / Clinical cryptococcosis was observed on day 1 postinoculation (PI), and the animals survived until day 15 PI. C. neoformans was isolated from brain tissue starting on day 5 PI, and from lung tissue starting on day 11 PI. On day 1 PI, signs of infection were already observed in brain tissue, with presence of edema, which evolved throughout the period. C. neoformans was first seen in the capillaries, suggesting that this is an important route for the entrance of the yeast into this organ. Acute meningitis occurred around day 7 PI, when the microorganism was observed in the meninges, along with a discrete inflammatory infiltrate. From day 13 PI onward the disease became chronic, persisting until the death of the animals. Treatment with amphotericin B (AMB) alone shortened the animals\' survival, while treatment with fluconazole (FLC) alone lengthened it. Treatment with the two drugs in association was effective when treatment was begun at 24 hours PI, however, when treatment was begun at day 7 PI, already with signs of acute meningitis, the effectiveness was unsatisfactory. It is important to emphasize that these results relate to inoculation with an isolate susceptible in vitro to fluconazole, while the treatment was not effective for an isolate resistant in vitro to fluconazole.

A criptococose clinica foi observada por volta do primeiro dia da inoculação e a sobrevida dos animais 15 dias após-inoculação (PI). Isolamos C. neoformans no cérebro a partir do 5º dia (PI) e no pulmão a partir 11º dia (PI). No 1º dia (PI) observamos por meio do tecido cerebral que já havia um quadro inicial de infecção, presença de edema, que evoluiu durante todo o período. C. neoformans foi visualizado primeiramente nos vasos capilares, o que nos leva a sugerir que seja esta rota importante para a entrada da levedura no órgão. A meningite aguda aconteceu por volta do 7º dia quando visualizamos o microrganismo na meninge e com um discreto infiltrado inflamatório. A partir do 13º dia a doença evoluiu para crônica permanecendo até o óbito dos animais. A monoterapia com anfotericina B (AMB) reduziu a sobrevida dos animais, enquanto que, o tratamento isolado com fluconazol (FLC) prolongou a mesma. A associação AMB-FLC foi eficaz, quando iniciamos o tratamento 24 horas (PI), enquanto que, o mesmo tratamento iniciado a partir do 7º dia quando já tínhamos um quadro compatível de meningite aguda não foi satisfatório. É importante ressaltar que os resultados descritos foram referentes à inoculação com isolado sensível in vitro ao fluconazol, enquanto que, o tratamento não resultou em êxito quando empregamos isolado resistente in vitro ao fluconazol. / Clinical cryptococcosis was observed on day 1 postinoculation (PI), and the animals survived until day 15 PI. C. neoformans was isolated from brain tissue starting on day 5 PI, and from lung tissue starting on day 11 PI. On day 1 PI, signs of infection were already observed in brain tissue, with presence of edema, which evolved throughout the period. C. neoformans was first seen in the capillaries, suggesting that this is an important route for the entrance of the yeast into this organ. Acute meningitis occurred around day 7 PI, when the microorganism was observed in the meninges, along with a discrete inflammatory infiltrate. From day 13 PI onward the disease became chronic, persisting until the death of the animals. Treatment with amphotericin B (AMB) alone shortened the animals\' survival, while treatment with fluconazole (FLC) alone lengthened it. Treatment with the two drugs in association was effective when treatment was begun at 24 hours PI, however, when treatment was begun at day 7 PI, already with signs of acute meningitis, the effectiveness was unsatisfactory. It is important to emphasize that these results relate to inoculation with an isolate susceptible in vitro to fluconazole, while the treatment was not effective for an isolate resistant in vitro to fluconazole.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-02-13T13:18:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE colação de grau.pdf: 1971286 bytes, checksum: 680d0e24d2f0efbe0313ab8752f1cc93 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T13:18:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE colação de grau.pdf: 1971286 bytes, checksum: 680d0e24d2f0efbe0313ab8752f1cc93 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / CNPq / A criptococose é uma infecção fúngica predominantemente oportunista cujos principais agentes etiológicos são Cryptococcus neoformans e C. gattii. O tratamento de escolha para a micose é a anfotericina B associada ou não a 5-fluorocitosina seguido de terapia de manutenção com fluconazol. Contudo, falhas no tratamento associadas à toxicidade e ao aparecimento de resistência aos fármacos têm sido relatadas, o que torna essencial a descoberta de novas alternativas terapêuticas, como a ciclopirox olamina (CPO). Neste contexto, o objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar a ação in vitro e in vivo da CPO livre e encapsulada em lipossomas frente a amostras de Cryptococcus neoformans para futura aplicação no tratamento da criptococose sistêmica. Foram obtidas 30 amostras de Cryptococcus neoformans provenientes de pacientes imunocomprometidos. A preparação dos lipossomas convencionais e furtivos de CPO foi realizada pelo método da hidratação do filme lipídico e a caracterização foi realizada avaliando os seguintes parâmetros: tamanho de partícula, Índice de Polidispersão (PDI) e taxa de encapsulação (EE%). Para otimização dos constituintes lipídicos, foi realizado um planejamento fatorial fracionado a 24-1 a partir da melhor formulação obtida nos estudos de pré-formulação. A cinética de liberação in vitro foi conduzida para avaliar e comparar estatisticamente o perfil de liberação dos sistemas convencional e furtivo. Adicionalmente, testes de susceptibilidade antifúngica foram realizados de acordo com Clinical and Laboratotry Standards Institute (CLSI). Para caracterização molecular dos isolados, PCR fingerprinting foi conduzida utilizando os primers M13 e URA5. O estudo in vivo foi conduzido com camundongos imunossuprimidos, infectados com Cryptococcus neoformans (106 cels/mL) e tratados com CPO lipossomal (Lipo-CPO) (0.5 mg/Kg). As concentrações de CPO utilizadas na forma livre e encapsuladas em lipossomas convencionais e furtivos variaram de 0,30 a 625 µg/mL. Os resultados do planejamento fatorial mostraram que o ponto central apresentou características proeminentes com redução do tamanho de partícula em 17,1%; melhora do PDI em 15,34% e da quantidade de fármaco encapsulado (25%). A cinética do lipossoma furtivo apresentou uma velocidade de liberação mais controlada quando comparada ao lipossoma convencional. Com relação ao teste de susceptibilidade, todos os inóculos foram susceptíveis a CPO livre, com atividade fungistática entre 0,30 e 0,61 g/mL e fungicida entre 1,22 e 4,88 g/mL. Não houve diferença relacionada à atividade antifúngica entre as formulações lipossomais convencionais e furtivas. A atividade fungistática dos lipossomas foi observada em concentrações variando de 1,22 e 2,44 g/mL. A faixa das concentrações fungicidas foi de 1,22 a 9,76 g/mL. O padrão de bandas do URA5 revelou que todos os isolados apresentam genótipo VNI, característico de C. neoformans. Lipo-CPO apresentou eficácia antifúngica comparada à anfotericina B após 14 dias de infecção, reduzindo a carga fúngica em aproximadamente 8% no baço, 41% no fígado, 63% no pulmão e 89% no cérebro. O exame histológico evidenciou infiltrado celular no fígado dos grupos tratados com Lipo-CPO e anfotericina B, porém com menor intensidade quando comparado ao grupo controle. O estudo sugere que a CPO encapsulada em lipossomas apresenta significativa ação antimicótica frente às amostras sistêmicas de C. neoformans, reforçando seu potencial na terapêutica da criptococose. / Cryptococcosis is an opportunistic fungal infection whose the main ethiological agents are Cryptococcus neoformans and C. gattii. The treatment of choice for this mycosis is amphotericin B combined or not with 5-fluorocytosine, followed by maintenance therapy with fluconazole. However treatment failures associated with toxicity and drug resistance has been reported, which makes it essential to the discovery of new therapies, such as ciclopirox olamine (CPO). The purpose of this study was to characterize and evaluate the in vitro and in vivo antifungal activity of ciclopirox olamine in its free form and encapsulated in liposomes against thirty Cryptococcus neoformans isolates obtained from immunocompromised patients for future application in systemic cryptococcosis treatment. Preparation of conventional and stealth liposomes was performed to define particle size, polydispersity index (PDI), CPO amount of encapsulated and efficiency of encapsulation (EE%). For optimization of liposomal lipid constituents, a 24-1 fractional factorial design was carried out from the prominent formulation obtained in pre-characterization studies. In vitro release kinetics was conducted to evaluate and compare statistically the release profile of conventional and stealth liposomes. Antifungal susceptibility testing was conducted in accordance with the reference method. Regarding molecular characterization, PCR fingerprinting was carried out by using MT3 and URA5 primers. Concentrations of CPO used in free form and encapsulated into stealth and conventional liposomes ranged from 625 to 0.3 g.mL-1. Despite of the central point of the factorial design have increased the total lipids amount in 35.52%, it showed prominent characteristics when compared with the L4 formulation with improvement of the mean size in 17.1%, PDI in 15.34% and CPO amount in 25%. The minimum concentrations of stearylamine to obtain the stable formulation for one month was 5.88 mM. . Kinetics of stealth liposomes showed a release profile more controlled as compared to conventional liposomes. All inoculations were susceptible to CPO in its free form, presenting fungistatic activity between 0.3 and 0.61 g.mL-1 and fungicidal activity between 1.22 and 4.88 g.mL-1. There was no difference with respect to antimycotic activity between conventional and stealth liposomal formulations. Fungistatic activity of liposomes was observed at concentrations ranging from 1.22 and 2.44 g.mL-1. Fungicidal concentration range was 1.22-9.76 g.mL-1. The URA5 profile analized demonstrated all isolates are VNI genotype (C. neoformans). The treatment with Lipo-CPO showed a reduction of 8% of the C. neoformans population in spleen, 40.8% in liver, 63% in lungs and 89% in brain after 14 days of infection. Histological examination revealed cell infiltrate either Lipo-CPO or Amphotericin B treated groups, but less intense when compared to control group. The results suggest that Ciclopirox olamine loaded-liposomes have significant antimycotic activity against Cryptoccocus spp, reinforcing its potential for in vivo studies and its application in cryptococcosis treatment.