Calculo renal, também conhecido como urolitíase, é comum com uma taxa de prevalência estimada global recente de 14,8%, a qual parece estar aumentando, com uma taxa de recorrência em cinco anos de até 50%. As várias atividades biológcas promissoras de extratos de plantas ricas em ácidos galolquínicos, como as folhas das espécies de Copaifera, levaram nosso interesse em sintetizar o éster metílico do ácido 3,4,5-tri-O-galoilquinico trissubstituído (TGAME), com o objetivo de desenvolver um composto com potencial para prevenção de cálculos renais. A síntese total incluiu seis etapas a partir dos ácidos quínico e gálico disponíveis comercialmente. O passo-chave na via sintética foi a esterificação de Steglich viável do quinato de metila com ácido 3,4,5-tribenziloxibenzóico usando diciclo-hexilcarbodiimida e N, N-(dimetilamino)piridina como reagentes de acoplamento. As estruturas químicas do composto final e seus intermediários sintéticos foram elucidados por métodos espectroscópicos, espectrométricos e espectrofotométricos de análises. O efeito potencial do composto sobre a ligação de cristal monoidratado de oxalato de cálcio (COM) à superfície de células de rim caninas tipo I de Madin-Darby (MDCKI) e o crescimento de cristais em modelo de túbulos Malpighi de Drosophila melanogaster foi investigado. As quantidades de membrana, citosólica e total de Annexina A1 (ANXA1), Alfa-enolase e HSP90 foram examinadas por análise de transferência de Western após fracionamento subcelular, as quais foram confirmadas por coloração por imunofluorescência de células cultivadas. O pré-tratamento de células MDCKI com TGAME por até 6 h diminuiu significativamente a ligação de cristal COM de uma maneira dependente da concentração. O TGAME (50 ?M) inibiu significativamente a expressão superficial de ANXA1 por microscopia de imunofluorescência, enquanto o ANXA1 intracelular aumentou. A análise de Western Blot confirmou alterações de expressão de ANXA1 na membrana e frações citosólicas de células tratadas com os compostos, enquanto a ANXA1 de células inteiras permaneceu inalterada. O TGAME também diminuiu significativamente o tamanho, o número e o crescimento de cristais de COM induzidos em um modelo de túbulos Malpighi de Drosophila melanogaster, o qual apresentou também potente atividade antioxidante em um ensaio de DPPH. Adicionalmente, realizamos estudos de biotransformação de derivados do ácido galoilquínico, utilizando fungos filamentosos, para prever seus comportamentos farmacocinéticos. Os resultados mostraram que os ácidos galoilquínicos das folhas de Copaifera lucens (fração n-butanólica, BF) foram transformados por Aspergillus alliaceus em um metabólito majoritário, o ácido 3-O-metil gálico (M1), que é um dos metabolitos conhecidos do ácido gálico estudado em humanos. O produto biotransformado foi identificado por UPLC-MS/MS. O pré-tratamento de células MDCKI com BF e seu produto transformado por 3 h diminuiu significativamente a ligação de cristal COM a estas células em concentrações de 50 ?g/mL e 5 ?M, respectivamente. Os compostos reduziram significativamente a expressão superficial das ANXA1 e HSP90 (proteínas de ligação COM) como evidenciado por microscopia de imunofluorescência, enquanto o nível intracelular aumentou. A análise por Western blot confirmou estas alterações nas frações de membrana e citosol das células tratadas com estes compostos, enquanto as células inteiras permaneceram inalteradas. M1 também apresentou atividade antioxidante promissora no ensaio DPPH. / Renal stone disease, also known as urolithiasis, is common with a recent overall estimated prevalence rate of 14.8% that appears to be rising, with a five-year recurrence rate of up to 50%. The promising diverse bioactivities of plant extracts rich in galloylquinic acids such as Copaifera species leaves prompted our interest to synthesize the tri-substituted 3,4,5-tri-O-galloylquinic acid methyl ester (TGAME), with the goal of developing a lead compound for kidney stone prevention. The total synthesis included six steps starting from commercially available quinic and gallic acids. The key step in the synthetic pathway was through Steglich esterification of methyl quinate with 3,4,5-tribenzyloxybenzoic acid using dicyclohexylcarbodiimide and N,N-(dimethylamino) pyridine as the coupling reagents. The chemical structures of the final compound and its synthetic intermediates were elucidated by spectroscopic, spectrometric and spectrophotometric methods of analyses. The potential effect of the compound on calcium oxalate monohydrate (COM) crystal binding to the surface of Madin-Darby Canine Kidney Cells type I (MDCKI) and crystal growth in a Drosophila melanogaster Malpighian tubule model were investigated. Membrane, cytosolic and total Annexin A1 (ANXA1), ?-enolase and HSP90 amounts were examined by Western blot analysis after subcellular fractionation, then confirmed by immunofluorescence staining of cultured cells. Pretreatment of MDCKI cells with TGAME for up to 6 h significantly diminished COM crystal-binding in a concentration-dependent manner. TGAME (50 ?M) significantly inhibited ANXA1 surface expression as evident by immunofluorescence microscopy, whereas intracellular ANXA1 increased. Western blot analysis confirmed ANXA1 expression changes in the membrane and cytosolic fractions of compound-treated cells, whereas the whole cell ANXA1 remained unchanged. TGAME also significantly decreased the size, number, and growth of COM crystals induced in a Drosophila melanogaster Malpighian tubule model, and possessed a potent antioxidant activity in a DPPH assay. We also have performed a biotransformation study of galloylquinic acid compounds using filamentous fungi to predict their pharmacokinetic behaviors. The results showed that galloylquinic acids from Copaifera lucens leaves (n-butanolic fraction, BF) were transformed by Aspergillus alliaceus into one major metabolite 3-O-methyl gallic acid (M1), which is one of the known metabolites of gallic acid studied in humans. The biotransformed product was identified by UPLC-DAD-MS/MS and 1H NMR. Pretreatment of MDCKI cells with BF (50 ?g/mL) and its transformed product M1 (5 ?M) for 3 h significantly diminished COM crystal-binding to these cells. The compounds significantly reduced surface expression of ANXA1 and HSP90 (COM-binding proteins) as evidence by immunofluorescence microscopy, whereas the intracellular level increased. Western blot analysis confirmed these changes in membrane and cytosolic fractions of compound-treated cells, whereas whole cells remained unchanged. M1 also showed a promising antioxidant activity in DPPH assay.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1278229 bytes, checksum: eed1e8ad3234857f397ab4b1785eb2b1 (MD5) Previous issue date: 2010-07-07 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Ectomycorrhizal fungi associated with eucalypt roots may induce the storage of calcium in the form of calcium oxalate crystals in the root system of the host plant. Despite of the great demand for calcium by the plants of this genus and the low calcium availability in Brazilian soils, little is known about the calcium storage capacity and organic acids efflux displayed by ectomycorrhizal depending on the availability of this element. Thus, this study aimed to characterize calcium crystals in ectomycorrhizas of Eucalyptus sp., their distribution, morphology and chemical composition, and to assess the ability of ectomycorrhizal fungi to accumulate calcium and produce organic acids when grown under different concentrations of calcium in the growth medium. In ectomycorrhizas of Eucalyptus sp., the crystals were observed inside root cortical cells. Three different distribution patterns were observed and classified as regular, irregular or smooth. The scanning electron microscopy combined with energy dispersive X-ray microprobe analysis allowed to classify the morphologies of the predominant crystals as granules and concretions, although other morphological types have also been highlighted. Calcium, oxygen and carbon are the major constituents of these crystals, which were characterized as calcium oxalate crystals. In general, ectomycorrhizal fungi exhibited a pattern of calcium accumulation in mycelium responding positively to the increase of the element concentration in the growth medium. However, the concentration of calcium in the medium does not seem to influence the production of fungal biomass. Under conditions of lower calcium concentration in the medium, the isolates had higher calcium utilization efficiency. The acetic/gluconic, butyric, oxalic and citric acids were detected in the growth medium of ectomycorrhizal isolates evaluated. The concentration of calcium in the medium influenced exudation of acids acetic/gluconic, butyric and oxalic by the isolate Pisolithus sp. PT06, which also showed the highest production of these compounds in comparison to others. This, may be related to lower accumulation of fungal biomass exhibited by this isolate. The concentration of butyric acid in the growth medium of isolate Pisolithus tinctorius PTFRA was higher when the concentration of calcium was smaller, similar to isolate Pisolithus sp. PT06. This is the first report about the detailed morphology and chemical constitution of predominant crystals in ectomycorrhizal of eucalypts. Moreover, the results corroborate the role of ectomycorrhizal fungi in calcium acquisition from soil and suggest that different isolates may have different capacities of cycling calcium, either by biomass accumulation or efflux of organic acids. / Fungos ectomicorrízicos associados à raízes de eucalipto podem induzir o armazenamento de cálcio sob a forma de cristais de oxalato de cálcio no sistema radicular da planta hospedeira. Apesar da grande demanda por cálcio pelas plantas desse gênero e a baixa disponibilidade em solos brasileiros, pouco se sabe sobre as capacidades de armazenamento de cálcio e efluxo de ácidos orgânicos exibidas por fungos ectomicorrízicos em função da disponibilidade do elemento. Sendo assim, este trabalho teve por objetivo caracterizar cristais de cálcio presentes em ectomicorrizas de Eucalyptus sp., quanto a sua distribuição, morfologia e composição química, além de avaliar a capacidade de fungos ectomicorrízicos em acumular cálcio e produzir ácidos orgânicos quando cultivados sob diferentes concentrações do elemento. Nas ectomicorrizas de Eucalyptus sp., os cristais foram evidenciados no interior de células corticais radiculares. Três diferentes padrões de distribuição foram observados e classificados como regular, irregular ou homogêneo. A Microscopia Eletrônica de Varredura associada a microssonda de análise de energia dispersiva de raios-X permitiu classificar as morfologias predominantes dos cristais como grânulos e concreções, embora outros tipos morfológicos também tenham sido evidenciados. Cálcio, oxigênio e carbono são os principais elementos constituintes desses cristais, que diante de todos os resultados obtidos foram seguramente caracterizados como cristais de oxalato de cálcio. De modo geral, fungos ectomicorrízicos exibiram um padrão de acúmulo de cálcio no micélio respondendo positivamente ao aumento da concentração do elemento no meio de cultivo. Contudo, a dose de cálcio no meio parece não influenciar a produção de biomassa fúngica. Sob condições de menor concentração de cálcio no meio, os isolados apresentaram maior eficiência de utilização de cálcio. Os ácidos acético/glucônico, butírico, oxálico e cítrico foram detectados no meio de cultivo dos isolados ectomicorrízicos avaliados. A dose de cálcio no meio de cultivo influenciou a exsudação dos ácidos acético/glucônico, butírico e oxálico pelo isolado Pisolithus sp. PT06, que também apresentou a maior produção desses compostos em comparação aos demais e isso pode estar relacionado ao menor acúmulo de biomassa fúngica exibido por esse isolado. A concentração do ácido butírico no meio do isolado Pisolithus tinctorius PTFRA foi influenciada pela dose de cálcio, sendo maior onde a concentração de cálcio era menor, padrão semelhante ao do isolado Pisolithus sp. PT06. Este é o primeiro relato sobre a morfologia detalhada e constituição química de cristais predominantes em ectomicorrizas de eucalipto. Além disso, os resultados apresentados corroboram o papel de fungos ectomicorrízicos na aquisição de cálcio do solo e sugerem que diferentes isolados podem apresentar capacidades distintas de atuação nos processos envolvendo a ciclagem do cálcio, seja pelo efluxo de ácidos orgânicos e/ou acúmulo na biomassa.