Submitted by Dominick Jesus (dominickdejesus@hotmail.com) on 2016-02-11T18:56:57Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Aline Almeida Mattos.pdf: 3417727 bytes, checksum: c5c27457db3dabcfb4b55c7e2378496e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-11T18:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Aline Almeida Mattos.pdf: 3417727 bytes, checksum: c5c27457db3dabcfb4b55c7e2378496e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2007-10-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The species Simulium guianense s.l. Wise is incriminated as the main vector of Onchocerca volvulus Leuckart, which is the ethiologic agent of oncocerciasis in the Amazonian focus of the disease, located in the northern portion of South América. The objectives of this study were to analyze different populations of this species using polythene chromosomes and mitochondrial gene sequences of the COI region to evaluate the relationships among these populations. The specimens for the cytotaxonomic study were collected in the Brazilian states of Amazonas, São Paulo and Goiás (Rio Ponte de Pedra) and for the molecular study the specimens were collected in the states of Amazonas, Amapá, Goiás (Rios Ponte de Pedra and Verdão), Maranhão and Roraima (one population from the Homoxi oncocerciasis focus and two from sites outside of the focus: Caroebe and Surumu). The polythene chromosomes from the analyzed populations were compared with a standard map that had been previously established for this species. The cytological analysis indicates the presence of polymorphic inversion in the Amazonas and São Paulo populations; the population from Goiás (Rio Ponte de Pedras) had two fixed inversions. Comparing 702 bp from the COI mithochondrial gene in the nine studied populations, a considerable number of polymorphic sites were observed, thereby allowing population and phylogeographic analyses to be undertaken. A representative cladogram was constructed to analyse the relationships among the observed haplotypes. The cladogram suggests that the populations from the northern region of Brazil (Amapá, Amazonas and the Caroebe site in Roraima) share one haplotype, while the populations from the Amazonian focus (Homoxi site in Roraima) is most closely related to the population from the Surumu site in Roraima, as these populations share a common haplotype. The populations from São Paulo and Goiás, Rio Verdão (from the southeast and centro-west regions of Brazil, respectively) have high haplotypic variability, each specimen being represented by one haplotype. The population from the Rio Ponte de Pedra site in Goiás did not share haplotypes with any of the other populations studied, including the population from the Rio Verdão site in Goiás, located approximately 50 Km away in the same hydrological basin. The populations from Amazonas and the Caroebe site in Roraima had negative values of F ST, suggesting that they exchange alleles freely and do not show any genetic structure. The population from Maranhão is well sructured in relation to the others with a low number of migrants; this population appears to be derived from the population in São Paulo. The NJ phylogeographic tree constructed using the F ST values indicates the division of the analyzed populations into two groups separated by the Amazon River. The northern group is represented by the populations in Amapá, Roraima (Surumu, Homoxi and Caroebe) and Amazonas, while the southern group is represented by Maranhão, the Rio Verdão site in Goiás, and São Paulo. The results obtained by cytological and molecular techniques suggested that the S. guianense s.l. populations analyzed, in general, do not constitute a species complex, as has been suggested by some authors, even though the populations had high genetic variability. The only exception is the population from Goiás (Rio Ponte de Pedra), which probably represents a species that is new to science. / A espécie Simulium guianense s.l. Wise é incriminada como principal vetor de Onchocerca volvulus Leuckart, causadora da oncocercose no foco Amazônico, localizado no norte da América do Sul. Os objetivos do presente estudo foram analisar diferentes populações dessa espécie utilizando cromossomos politênicos e seqüências da região do gene mitocondrial COI, para avaliar as relações entre essas diferentes populações. Para a análise cromossômica, os espécimes foram coletados nos estados do Amazonas, São Paulo e Goiás (Rio Ponte de Pedra) e para a análise molecular foram coletados nos estados do Amazonas, Amapá, Goiás (Rios Ponte de Pedra e Verdão), Maranhão e Roraima (uma população na área do foco de oncocercose-Homoxi e, duas fora da área do foco, Caroebe e Surumu). Os cromossomos politênicos das populações analisadas foram comparados com mapas estabelecidos anteriormente para essa espécie. As análises citológicas do padrão de bandas dos cromossomos politênicos mostraram inversões polimórficas, na condição heterozigota nas populações do Amazonas e São Paulo, e a de Goiás (Rio Ponte de Pedras) apresentaram duas inversões fixas. Comparando 702 pb da região do gene mitocondrial COI das nove populações estudadas, um valor considerável de sítios polimórficos foram observados, permitindo estudos populacionais e filogeográficos. Um cladograma representativo foi construído a fim de relacionar os haplótipos detectados, permitindo observar que as populações do norte, Amapá, Amazonas e RR-Caroebe compartilham um mesmo haplótipo, enquanto a área do foco Amazônico (RR-Homoxi) está mais relacionada com as populações de RR-Surumu, compartilhando um haplótipo em comum. As populações de São Paulo e Goiás, Rio Verdão (das regiões sudeste e centro-oeste, respectivamente) apresentam elevada variabilidade haplotípica, onde cada indivíduo é representado por um haplótipo. A população do Rio Ponte de Pedra, de Goiás não compartilhou haplótipos com as outras populações estudadas, nem mesmo com a do Rio Verdão, também em Goiás, localizada a aproximadamente 50 Km de distância. As populações do Amazonas e RR-Caroebe apresentaram valores negativos de F ST, sugerindo que elas, trocam alelos livremente, representando uma população sem estrutura genética. A população do Maranhão, que se mostrou bem estruturada em relação às outras, tem baixo número de migrantes, mas parece ser derivada da população de São Paulo. Usando os valores de F ST uma árvore filogenética de NJ foi gerada e pode-se observar uma separação entre os grupos ao norte da calha do Rio Amazonas, representados por indivíduos do Amapá, RR (Surumu, Homoxi e Caroebe) e Amazonas, e outro ao sul da calha do Rio Amazonas (Maranhão, GO-Rio Verdão e São Paulo). Os resultados obtidos, utilizando técnicas citogenéticas e moleculares, sugerem que as populações de S. guianense s.l. analisadas, no geral, não fazem parte de um complexo de espécie, como sugerido por alguns autores, apesar de apresentar acentuada variabilidade genética. A exceção é a população de Goiás (Rio Ponte de Pedra) que, provavelmente, representa uma nova espécie para a Ciência.

Com a idéia de identificar proteínas envolvidas no processo de enovelamento das proteínas sintetizadas na glândula salivar de Rhynchosciara americana, no início deste projeto adotou-se como estratégia o seqüenciamento de uma biblioteca de cDNA. Esta biblioteca foi construída utilizando-se glândulas salivares de Rhynchosciara americana do período de seu desenvolvimento onde tem início a síntese de seu casulo. Mensagens de proteínas envolvidas no processo de enovelamento, transporte e proteólise foram isoladas, alguns exemplos são hsc70, hsp83, hip, hop, dnaJ, trap1 e prolil isomerase, sec61α/β, sec23, peptidase de sinal, rab7, partícula reconhecedora de sinal (srp), enzima conjugadora de ubiquitina e complexo regulatório proteassomo 26, cop 1 e ubiquitina ligase. A identificação destes genes permitiu o isolamento de clones genômicos através de triagem em banco de fagos e caracterização dos genes hsc70 e hsp83 para verificação de sua organização em Rhynchosciara americana. A expressão dos seus respectivos mRNAs foi avaliada em vários períodos do último estágio larval. A localização por hibridização in situ mostrou que estes genes estão localizados em regiões dos cromossomos politênicos próximas a dois pufes de DNA, C3 e C8. O estudo dos níveis de expressão das proteínas codificadas pelos genes hsc70 e hsp83 mostrou a diferença de comportamento destes genes sob condições de estresse térmico e que a expressão destas proteínas deve ser regulada pelo período de desenvolvimento das larvas de Rhynchosciara americana. Quando evidenciada por imunofluorescência a proteína Hsc70 mostra localização predominantemente no citoplasma. / With the idea of identify some of these proteins involved in the folding process of the proteins synthesized on the Rhynchosciara salivary gland, this project started adopting the shotgun cDNA sequencing strategy. This cDNA library was constructed utilizing salivary glands of Rhynchosciara americana at a developmental period where the cocoon construction begins. Messengers of important proteins involved in the folding, transport and proteolysis process were isolated, some examples are hsc70, hsp83, hip, hop, sec61 α/β, sec23, signal peptidase, rab7, signal recognition particle (srp), ubiquitin conjugating enzyme e 26 proteasome regulatory complex, cop 1 and ubiquitin ligase. Identification of these genes allowed the screening of genomic clones from a phage library; hsc70 and hsp83 characterization was carried out to verify the arrangement of these genes on genome of Rhynchosciara americana. The study of these genes will contribute with phylogenetic information about the specie. The mRNA expression of these genes was analyzed during several periods of the last larval developmental stage. In situ localization showed that these genes are located in polytene chromosomes regions near two DNAs puffs, C3 and C8. The expression levels of the proteins codified by genes hsc70 and hsp83 showed different behaviors of these genes under heat stress conditions and mainly, that the regulation of the proteins Hsc70 and Hsp83 can be related to the period of development of the larvae of Rhynchosciara americana. When revealed by immunofluorescence, Hsc70 protein shows localization predominantly on the cytoplasm.

Com a idéia de identificar proteínas envolvidas no processo de enovelamento das proteínas sintetizadas na glândula salivar de Rhynchosciara americana, no início deste projeto adotou-se como estratégia o seqüenciamento de uma biblioteca de cDNA. Esta biblioteca foi construída utilizando-se glândulas salivares de Rhynchosciara americana do período de seu desenvolvimento onde tem início a síntese de seu casulo. Mensagens de proteínas envolvidas no processo de enovelamento, transporte e proteólise foram isoladas, alguns exemplos são hsc70, hsp83, hip, hop, dnaJ, trap1 e prolil isomerase, sec61α/β, sec23, peptidase de sinal, rab7, partícula reconhecedora de sinal (srp), enzima conjugadora de ubiquitina e complexo regulatório proteassomo 26, cop 1 e ubiquitina ligase. A identificação destes genes permitiu o isolamento de clones genômicos através de triagem em banco de fagos e caracterização dos genes hsc70 e hsp83 para verificação de sua organização em Rhynchosciara americana. A expressão dos seus respectivos mRNAs foi avaliada em vários períodos do último estágio larval. A localização por hibridização in situ mostrou que estes genes estão localizados em regiões dos cromossomos politênicos próximas a dois pufes de DNA, C3 e C8. O estudo dos níveis de expressão das proteínas codificadas pelos genes hsc70 e hsp83 mostrou a diferença de comportamento destes genes sob condições de estresse térmico e que a expressão destas proteínas deve ser regulada pelo período de desenvolvimento das larvas de Rhynchosciara americana. Quando evidenciada por imunofluorescência a proteína Hsc70 mostra localização predominantemente no citoplasma. / With the idea of identify some of these proteins involved in the folding process of the proteins synthesized on the Rhynchosciara salivary gland, this project started adopting the shotgun cDNA sequencing strategy. This cDNA library was constructed utilizing salivary glands of Rhynchosciara americana at a developmental period where the cocoon construction begins. Messengers of important proteins involved in the folding, transport and proteolysis process were isolated, some examples are hsc70, hsp83, hip, hop, sec61 α/β, sec23, signal peptidase, rab7, signal recognition particle (srp), ubiquitin conjugating enzyme e 26 proteasome regulatory complex, cop 1 and ubiquitin ligase. Identification of these genes allowed the screening of genomic clones from a phage library; hsc70 and hsp83 characterization was carried out to verify the arrangement of these genes on genome of Rhynchosciara americana. The study of these genes will contribute with phylogenetic information about the specie. The mRNA expression of these genes was analyzed during several periods of the last larval developmental stage. In situ localization showed that these genes are located in polytene chromosomes regions near two DNAs puffs, C3 and C8. The expression levels of the proteins codified by genes hsc70 and hsp83 showed different behaviors of these genes under heat stress conditions and mainly, that the regulation of the proteins Hsc70 and Hsp83 can be related to the period of development of the larvae of Rhynchosciara americana. When revealed by immunofluorescence, Hsc70 protein shows localization predominantly on the cytoplasm.