Helical membrane proteins comprise one third of the expressed proteins encoded in a typical genome. Other membrane proteins are typically beta sheets. Their function varies from pore formation, signaling to antimicrobial activity. They are also capable of transporting large cargo such as proteins or nucleic acids across the cell membrane. Recently, peptides have emerged as promising tools in drug delivery. Membrane proteins can be synthesized chemically or expressed and isotopically labeled in bacteria, isolated, purified and reconstituted into fully hydrated lipid bilayers. The bilayer orientation is kept mechanically by putting them between glass plates. While interacting with these bilayers they exhibit a variety of configurations depending on the lipids composition and thickness. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (NMR) on oriented bilayers is one way to access the topology of peptides associated with phospholipid membranes. Oriented membrane protein are difficult to study with analytical techniques because of their poor solubility outside the lipid membrane, difficulty of expression in bacteria in big quantities, difficulty to crystallize, and they are too large for solution NMR study. The intensity of an NMR signal depends on several factors such as polarization P and magnetic field magnitude B0. One of the major drawbacks of NMR spectroscopy is low sensitivity. This is caused by the small magnetic moment of the nuclear spins which results in a modest Zeeman splitting of the nuclear spin energy levels and therefore in a limited Boltzmann Polarization. The aim of this project is to obtain a better signal from membrane proteins. Thus a Low temperature (LT) solid state NMR with Dynamic Nuclear Polarization (DNP) probe head was created. DNP is an ingenious technique that is used to transfer polarization from highly polarized targets to less polarized nuclei using microwave irradiation. Microwaves will excite selectively the electron spins which will transfer their polarization to the pool of proton nuclei, the proton NMR signal can be enhanced by 660 times. A probe head for DNP enhanced solid state NMR at 100 K and 9.4 T is described. A probe head includes the mechanical piece that holds the sample in the magnetic center of the NMR magnet. It is a tunable antenna that irradiates and detects the rf fields used in NMR. The centerpiece of the probe is the solenoidal or saddle coil surrounding the sample. The feasibility of such a DNP experiment is proven on magic angle oriented sample spinning. These experiments are conducted on oriented samples wrapped into a rotor. Through their orientation with regards to B0 is lost, enhancement values as high as 17 are obtained. [...]

Les protéines membranaires en hélices alpha forment le tiers des protéines codées par notre génome. D’autres protéines membranaires sont formées typiquement de feuillets bêta. Leur fonction varie de la formation de pores, la transmission de signaux à l’activité antibiotique. Elles sont aussi capables de transporter de larges cargos comme les protéines ou les acides nucléiques au travers de la membrane. Récemment, les peptides ont émergé comme un moyen prometteur pour le transport de médicaments vers leurs cibles.Les protéines membranaires peuvent être synthétisées chimiquement ou exprimées et marquées isotopiquement dans les bactéries, isolées, purifiées et reconstituées dans les bicouches lipidiques hydratées. Elles présentent une variété de configurations en interagissant avec ces bicouches lipidiques. Ceci dépend de la composition et de l’épaisseur de ces bicouches. L’orientation des bicouches lipidiques est maintenue mécaniquement en les disposant entre des plaques de verre. La RMN du solide des échantillons orientés est un des moyens possibles pour accéder à la topologie des peptides associés à des membranes phospholipidiques. Les échantillons sont difficiles à exprimer dans les bactéries en grande quantités et possède une solubilité réduite en dehors des membranes. En outre leur taille est trop importante pour la RMN du liquide et il est difficile de les cristalliser. Un des inconvénients majeur de la spectroscopie RMN est sa faible sensibilité. Cela résulte du faible moment magnétique nucléaire qui résulte en un décalage Zeeman faible et donc une polarisation réduite. Par ailleurs, l’intensité du signal RMN dépend de plusieurs facteurs comme la quantité d’échantillon la polarisation et le champ magnétique B0. Et le temps d’acquisition de certaines expériences peut être très long. Le but de ce projet est d’obtenir plus de signal des protéines membranaires. Dès lors, nous avons développé une cryosonde DNP (dynamic nuclear polarization) / RMN du solide. La DNP est une technique ingénieuse qui est utilisée pour le transfert de polarisation des noyaux hautement polarisés à des noyaux moins polarisés par irradiation microonde. Les microondes vont exister sélectivement les électrons qui transfèreront leur polarisation à l’ensemble des protons voisins, le signal proton peut ainsi être augmenté de 660 fois.Pour cela la cryosonde DNP RMN du solide qui opère à 100 K et 9,4 T a été utilisée. Une sonde est la pièce mécanique qui maintient l’échantillon dans le centre magnétique de l’aimant du spectromètre. C’est une antenne modulable qui irradie et détecte des champs radiofréquence. La pièce centrale de la sonde est une bobine solénoïdale ou une bobine en forme de selle enveloppant l’échantillon. La faisabilité de ces expériences DNP a été validée sur les échantillons orientés en rotation à l’angle magique. Ces expériences ont été menées sur des échantillons enroulés dans un rotor. Même si leur orientation par rapport au champ magnétique B0 est perdue, une valeur d’augmentation de 17 a été obtenue.[...] / Helical membrane proteins comprise one third of the expressed proteins encoded in a typical genome. Other membrane proteins are typically beta sheets. Their function varies from pore formation, signaling to antimicrobial activity. They are also capable of transporting large cargo such as proteins or nucleic acids across the cell membrane. Recently, peptides have emerged as promising tools in drug delivery. Membrane proteins can be synthesized chemically or expressed and isotopically labeled in bacteria, isolated, purified and reconstituted into fully hydrated lipid bilayers. The bilayer orientation is kept mechanically by putting them between glass plates. While interacting with these bilayers they exhibit a variety of configurations depending on the lipids composition and thickness. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (NMR) on oriented bilayers is one way to access the topology of peptides associated with phospholipid membranes. Oriented membrane protein are difficult to study with analytical techniques because of their poor solubility outside the lipid membrane, difficulty of expression in bacteria in big quantities, difficulty to crystallize, and they are too large for solution NMR study. The intensity of an NMR signal depends on several factors such as polarization P and magnetic field magnitude B0. One of the major drawbacks of NMR spectroscopy is low sensitivity. This is caused by the small magnetic moment of the nuclear spins which results in a modest Zeeman splitting of the nuclear spin energy levels and therefore in a limited Boltzmann Polarization. The aim of this project is to obtain a better signal from membrane proteins. Thus a Low temperature (LT) solid state NMR with Dynamic Nuclear Polarization (DNP) probe head was created. DNP is an ingenious technique that is used to transfer polarization from highly polarized targets to less polarized nuclei using microwave irradiation. Microwaves will excite selectively the electron spins which will transfer their polarization to the pool of proton nuclei, the proton NMR signal can be enhanced by 660 times. A probe head for DNP enhanced solid state NMR at 100 K and 9.4 T is described. A probe head includes the mechanical piece that holds the sample in the magnetic center of the NMR magnet. It is a tunable antenna that irradiates and detects the rf fields used in NMR. The centerpiece of the probe is the solenoidal or saddle coil surrounding the sample. The feasibility of such a DNP experiment is proven on magic angle oriented sample spinning. These experiments are conducted on oriented samples wrapped into a rotor. Through their orientation with regards to B0 is lost, enhancement values as high as 17 are obtained. [...]

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est désormais devenue une technique spectroscopique incontournable à de nombreux domaines de la science et de la médecine. Cependant, elle est limitée par une faible sensibilité en raison d'une polarisation nucléaire insuffisante, définie par la différence des populations entre les niveaux d'énergie impliqués, ce qui résulte à des temps expérimentaux assez longs. Cet inconvénient peut être compensé en transférant l’énorme polarisation des électrons non appariés aux spins nucléaires à l'aide d'une irradiation par micro-ondes à basse température - une méthode connue sous le nom de polarisation nucléaire dynamique (DNP). Sami Jannin et ses collègues ont récemment combiné la méthode de polarisation croisée (CP) avec la DNP, à des températures très basses, afin de polariser plus rapidement les noyaux de faible γ en transférant la polarisation des électrons aux protons et ensuite aux noyaux de faible γ, comme le carbone-13. Cette thèse démontre que l'efficacité de cette méthode peut être améliorée en arrêtant l'irradiation par micro-ondes pendant quelques centaines de millisecondes avant la CP. En effectuant ces expériences, la polarisation du carbone-13 de l'acétate de sodium [1-¹³C] peut monter jusqu'à 64% avec une constante de temps d'accumulation de polarisation très courte de 160 s. L'échantillon hyperpolarisé peut ensuite être rapidement dissous pour obtenir un signal RMN amplifié à l'état liquide et à la température ambiante. Cette méthode a été développée par Ardenkjaer-Larsen et ses collègues en 2003 et est connue sous le nom de polarisation nucléaire dynamique par dissolution (D-DNP). Elle peut fournir une amplification du signal d'un facteur jusqu'à quatre ordres de grandeur. La combinaison de la D-DNP avec les techniques de CP peut être utilisée pour créer des états de longue durée de vie (LLS) dans des molécules deutériées comme l'éthanol-d6 et le DMSO-d6. Ces états peuvent avoir des durées de vie beaucoup plus longues que l'aimantation conventionnelle de Zeeman. Ces états peuvent être détectés indirectement via des multiplets asymétriques dans les spectres RMN du carbone-13 en solution, à température ambiante après dissolution, via les couplages scalaires entre le carbone-13 et les noyaux du deutérium. Ces LLS résultent du déséquilibre des populations entre les représentations irréductibles des groupes de symétrie des molécules deutériées étudiées. Dans cette thèse, nous avons étudié les LLS dans les groupes CD₂ et CD₃. Les durées de vie de ces LLS peuvent dépasser les temps de relaxation T₁(²H) des noyaux de deutérium par un facteur jusqu'à 20 (dépendant de la dynamique moléculaire) et peuvent être observées par la décroissance de l'asymétrie du multiplet du carbone-13. Ces observations peuvent élargir les applications de la DNP en ajoutant le noyau de ²H à la liste des observables possibles / Nowadays, Nuclear Magnetic Resonance (NMR) has become an inevitable spectroscopic technique that can be applied in many fields of science and medicine. However it is limited by low sensitivity due to the low nuclear polarization, defined by the difference of populations between the energy levels involved, thus leading to long experimental times. This drawback can be overcome by using the huge polarization of unpaired electrons compared to nuclear spins and its transfer to nuclear spins at low temperatures (using microwave irradiation) to achieve a large nuclear magnetization - a method know as dynamic nuclear polarization (DNP). Sami Jannin and co-workers have recently combined the cross-polarization (CP) method with DNP at very low temperatures to polarize low γ nuclei faster by transferring the electron polarization to protons and then to low γ nuclei like ¹³C. This thesis demonstrates that the efficiency of the CP method can be improved by switching the microwave irradiation off for a few hundred milliseconds prior to CP. By performing these microwave gating experiments, ¹³C polarizations for sodium [1-¹³C]acetate as high as 64% could be achieved with a polarization build-up time constant as short as 160 s. The hyperpolarized sample can subsequently be rapidly dissolved to achieve NMR signal enhancement in the liquid state at ambient temperature. This method has been developed by Ardenkjaer-Larsen and co-workers in 2003 and became known as dissolution-dynamic nuclear polarization (D-DNP). It can provide signal enhancements by a factor of up to four orders of magnitude in liquid state at room temperature. Combining D-DNP with CP techniques from ¹H to ¹³C can be used to create to create long-lived states (LLS) in deuterated molecules like ethanol-d₆ and DMSO-d₆, which can have much longer life times than conventional Zeeman magnetization. These LLS can be detected indirectly via the asymmetric multiplets in ¹³C NMR spectra in solution state at room temperature after dissolution due to scalar couplings between ¹³C and ²H. These LLS result from population imbalances between spin manifolds of distinct irreducible representations of the relevant symmetry groups of the investigated deuterated moities. In this thesis we have investigated LLS in CD₂ and CD₃ groups. Lifetimes of these LLS can exceed the spin-lattice relaxation times T₁(²H) of deuterium nuclei by a factor up to 20 (depending on the underlying molecular dynamics) and can be obtained by monitoring the decay of the asymmetry of the ¹³C multiplet. These observations can expend the scope of DNP by adding ²H nucleus to the list of possible observables.