Citrillus colocynthis, plante de la famille des Cucurbitaceae, est utilisée en médecine traditionnelle en Afrique et en Asie pour traiter diverses affections. Elle contient comme principes actifs majoritaires des cucurbitacines. Sur les cellules mammifères en culture, les cucurbitacines provoquent, à dose nanomolaire, des changements morphologiques spectaculaires dans les minutes qui suivent leur application (blebbing, effondrement du volume cellulaire), accompagnés d’une agrégation massive de l’actine qui conduit dans les 24 heures à un défaut de cytokinèse avec multinucléation. Dans ce contexte, je me suis attachée à apporter des éléments pour mieux comprendre comment les cucurbitacines conduisent à l’agrégation de l’actine. Ce faisant, j’ai découvert que les agrégats formés sous l’effet des cucurbitacines ne sont pas de simples amas d’actine mais en fait des co-agrégats constitués d’un mélange d’actine et de phospho-myosine II. En analysant les voies de signalisation, j’ai pu montrer que la cucurbitacine I : I - Inhibe la phosphorylation de la cofiline par la LIMkinase, II - Active de façon très forte la voie RhoA/ROCK, III - Ne provoque pas de stress oxydant significatif et présente in vitro une réelle capacité à capturer le radical ˙OH, IV - Ne peut inhiber dans la cellule en culture la voie JAK2/STAT3 qu’à des concentrations micromolaires, V - Que les effets cyto-morphologiques de la cucurbitacine I ne sont neutralisés que par les antioxydants comportant des fonctions thiol dû à sa capacité à se conjuguer directement avec ces molécules, VI - La glycosylation supprime l’activité de ces molécules. La démonstration que ces molécules n’agissent pas en se couplant à des protéines cibles, ouvrent l’espoir raisonnable de les utiliser dans le futur pour créer des dérivés d’intérêt pour la pharmacologie du cancer. / Citrillus colocynthis, a plant from the Cucurbitaceae family, is used in traditional medicine in Africa and Asia to treat various diseases. It contains as major active molecules, cucurbitacins. On mammalian cells in culture, cucurbitacins at nanomolar dose, cause dramatic cyto-morphological changes in the minutes of their application (blebbing, collapse of the cell volume), accompanied by a massive aggregation of actin which leads within 24 hours to a defect of cytokinesis with multinucleation. In this context, I committed, to provide data to better understand how cucurbitacins lead to the aggregation of actin. In doing so, I discovered that the aggregates resulting from cucurbitacins are not simple actin clusters but in fact co-aggregates consisting of a mixture of actin and phospho-myosin II. By analyzing the signaling pathways, I was able to show that cucurbitacin I: I - Inhibits cofilin phosphorylation by LIMkinase, II -Very strongly activates the RhoA/ROCK pathway, III - Does not cause a significant and sustained oxidative stress in cultured cells, and presents in vitro a real ability to capture the OH radical. IV - Can inhibit in cultured cells the JAK2/STAT3 pathway only at micromolar concentrations, V - That the cyto-morphological effects of cucurbitacin I in mammalian cell are neutralized only by thiol-rich antioxidants, due of to the ability to combine directly with this molecule, VI - Glycosylation suppresses the activity of these molecules. The demonstration that these molecules do not act by coupling to target proteins, open the reasonable hope of using them to elaborate in the future derivatives of interest for the pharmacology of cancer.

Les statines sont des inhibiteurs sélectifs de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase, utilisées pour diminuer la biosynthèse du cholestérol. Ces molécules possèdent en plus de leur capacité à réduire le cholestérol des effets pléiotropiques comme les propriétés anti-inflammatoires et anti-oxydantes. Les cucurbitacines sont des triterpènes dérivés des plantes, ayant des propriétés biologiques diverses comme les effets anti-inflammatoires et anticancéreux, associées toutefois à une toxicité élevée. Les dérivés de thiazole sont des molécules contenant un noyau hétérocyclique formé de trois atomes de carbones, un atome de sulfure et un atome d'azote, disposant des effets anti-inflammatoires importantes. Les cyclooxygénases et les hème-oxygénases jouent un rôle dans l'inflammation et le stress oxydatif et sont les cibles des statines et des cucurbitacines in vitro. Les dérivés de thiazole peuvent inhiber plutôt l'activité enzymatique des cyclooxygénases. Le but de ma thèse est d'étudier les effets de ces 3 molécules in vivo et d'analyser si possible les mécanismes impliqués, comme par exemple pour les statines. Pour cela, nous avons eu recours chez les souris C57BL/6 au modèle d'inflammation de la poche à air-stérile injecté par le zymosan.Nous avons d'abord montré que le traitement des souris avec l'atorvastatine pendant 10 jours a réduit la migration des cellules dans l'exsudat de la poche à air ainsi que l'expression de gènes des marqueurs pro-inflammatoires tels que les cytokines, les chimiokines, la cyclooxygénase-2 et la nitric oxide synthase -II. Le taux de la prostaglandine E2 et de l'interleukine-6 a été également réduit. L'inhibition de l'hème-oxygénase-1 par son inhibiteur sélectif, tin protoporphyrine, a partiellement réduit l'effet inhibiteur de l'atorvastatine sur la migration des cellules et sur certaines cytokines suggérant un rôle important de la l'hème-oxygénase-1 dans les propriétés anti-inflammatoires in vivo.En parallèle, nous avons utilisé ce modèle animal tester l'effet de la cucurbitacine E sur l'inflammation et évaluer le rôle d'encapsulation in vivo dans des liposomes à base de phosphatidylcholine. Nous avons démontré que la cucurbitacine E libre (12.5 μg/poche ou 25 μg/poche) a tendance à diminuer l'interleukine-6, l'hème oxygénase-1 et la cyclooxygénase-2 alors que la cucurbitacine E encapsulée (12.5 μg/poche) a significativement réduit la prostaglandine E2, l'interleukine-6 et le taux de nitrite sans affecter le niveau d'ARNm de la cyclooxygénase-2 et l'hème oxygénase-1. Nos résultats suggèrent que l'incorporation de la cucurbitacine E dans des liposomes améliore son effet anti-inflammatoire et réduit sa cytotoxicité.Finalement, deux dérivés de thiazole qui diffèrent dans leur structure par la présence d'un groupement butyle- ou benzyle- sur leur chaîne latérale, ont été explorés dans ce modèle. Nous avons montré que le dérivé de thiazole contenant le groupe benzyle est sélectif de la cyclooxygénase-2 dans les macrophages et le modèle in vivo chez la souris.En résumé, mon travail de thèse met en évidence in vivo les effets anti-inflammatoires des statines et le rôle de l'hème oxygénase-1, et permet en plus la caractérisation des effets anti-inflammatoires des cucurbitacines et des dérivés de thiazole. L'ensemble de ces résultats renforcent les effets anti-inflammatoires de ces substances et démontre in vivo leur effet et les suggèrent comme molécules anti-inflammatoires. / Statins are selective competitive inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase used to lower cholesterol biosynthesis and have multiple pleiotropic effects beyond lowering cholesterol such as anti-inflammatory and anti-oxidant properties. Cucurbitacins are triterpenoid derived from plants and exhibit potential anti-inflammatory and anticancer properties though they have a high cytotoxicity. Thiazole derivatives are molecules containing heterocyclic ring with three carbons, one sulfur and one nitrogen atom, with important anti-inflammatory activities. Cyclooxygenases and heme-oxygenases play a role in inflammation and oxidative stress and are targets for statins or cucurbitacins in vitro. Thiazole derivatives are potential inhibitors of cyclooxygenases. The aim of my thesis is to investigate the anti-inflammatory effect of these three compounds in vivo and attempt to analyze the mechanisms involved, mainly for statins. Thus we set up an animal model of inflammation in C57BL/6 corresponding to the zymosan -injected dorsal sterile air pouch.First we have shown that treatment of mice with atorvastatin for 10 days reduced cell migration in the exudate of the air pouch as well as the expression of inflammatory markers such as cytokines, chemokines, cyclooxygenase-2 and nitric oxide synthase -II. The synthesis of prostaglandin E2 and interleukin-6 was also reduced. Inhibition of heme-oxygenase-1 by the selective inhibitor tin protoporphyrin partially diminished the inhibitory effect of statins on cell migration and some cytokines suggesting a significant role of HO-1 in the anti-inflammatory properties for atorvastatin in vivo.For cucurbitacins, we used the same animal model to investigate the effect of this substance in vivo and further assess the beneficial effect of encapsulating cucurbitacin in phosphatidylcholine-liposomes. Free cucurbitacin E (12.5 μg/pouch or 25 μg/pouch) tended to increase interleukin-6, decrease heme oxygenase-1 and cyclooxygenase-2 whereas cucurbitacin E loaded liposomes (12.5 μg/pouch) significantly reduced prostaglandin E2, interleukin-6 and nitrite without affecting cyclooxygenase-2 and heme oxygenase-1 mRNA levels. We demonstrated that the incorporation of Cuc E into liposomes enhances its anti-inflammatory effect and reduces its cytotoxicity.Finally, we used the dorsal air pouch model to investigate the anti-inflammatory effect of two thiazole derivatives that differ in their side chain by the presence of butyl or benzyl group. In addition to analyzing their effect on cyclooxygenase activity in human blood platelets, on recombinant COX-1 and in culture macrophage cell lines, we demonstrated their capacity to block cyclooxygenase-dependent prostaglandin synthesis in the lumen of the air pouch.In summary, my thesis presents in vivo evidence for the anti-inflammatory effects of atorvastatin dependent on HO-1 activity. My studies characterized the anti-inflammatory effects of cucurbitacins and thiazole derivatives. All these results support the anti-inflammatory effects of these substances and suggested them as potential anti-inflammatory substances.

La cucurbitacine E et l'érythrodiol sont des triterpènes naturels oxygénés ayant respectivement un squelette tétra et pentacyclique. Ils sont reconnus pour leurs diverses propriétés biologiques. Dans ce travail de thèse, nous étudions leur interaction avec les membranes des vésicules lipidiques dans le but de mieux comprendre leur pharmacodynamie. Nous avons préparé des liposomes en absence et en présence de la cucurbitacine E et de l'érythrodiol par les techniques d'évaporation en phase inverse suivie d'une extrusion, d'hydratation du film lipidique et d'injection d'éthanol. Les caractéristiques physicochimiques des vésicules lipidiques incorporant ou non la molécule triterpénique ont été étudiées par des techniques adéquates. Les analyses de la cucurbitacine E et de l'érythrodiol par la chromatographie liquide à haute performance ont montré que leurs taux d'incorporation dans les liposomes sont élevés. Les mesures de taille obtenues par la diffusion dynamique de la lumière ont démontré que les liposomes incorporant les triterpènes présentent une taille moyenne inférieure à celle des liposomes témoins. Les images obtenues par la microscopie électronique à transmission ont confirmé la formation de vésicules sphériques. Les mesures des dimensions des vésicules observées par la microscopie à force atomique (AFM), ont révélé que les liposomes incorporant la cucurbitacine E sont plus hauts et résistent mieux à la force exercée par la pointe AFM que les liposomes témoins. Par ailleurs, les liposomes incorporant l'érythrodiol sont plus fragiles que les liposomes témoins et ont tendance à éclater en bicouches lipidiques à la surface du support. Les courbes thermiques obtenues par la calorimétrie différentielle à balayage ont permis de conclure que la cucurbitacine E est localisée à l'interface polaire-apolaire de la membrane liposomiale alors que l'érythrodiol s'insère entre les chaînes acyles des phospholipides et aboutit à la formation des domaines hétérogènes au niveau de la membrane. La cinétique de libération de la sulforhodamine B, mesurée par la spectroscopie de fluorescence, a révélé que la membrane liposomiale devient, en présence de la cucurbitacine E, plus perméable à la sulforhodamine B incorporée dans la phase aqueuse interne. L'ensemble des résultats suggère que la cucurbitacine E et l'érythrodiol interagissent avec la membrane lipidique et affectent ses propriétés physico-chimiques. Leur effet sur la membrane ne semble pas être similaire. Des études ultérieures impliquant d'autres triterpènes sont envisagées pour identifier le (s) motif (s) structural (aux) et les paramètres physico-chimiques régissant leur interaction et localisation membranaire / Cucurbitacin E and erythrodiol are natural oxygenated triterpenes having respectively, a tetra and pentacyclic skeleton. They are known for their numerous biological properties. In this thesis, we studied their interaction with the membranes of lipid vesicles to better understand their pharmacodynamics. We have prepared liposomes in the absence and presence of cucurbitacin E and erythrodiol using the reverse phase evaporation technique followed by extrusion, the hydration of lipid film and the ethanol injection techniques. The physicochemical characteristics of lipid vesicles incorporating or not the triterpenic molecules were investigated by appropriate techniques. The determination of cucurbitacin E and erythrodiol in the vesicles by high performance liquid chromatography showed high incorporation efficiencies of both triterpenes. Size measurements obtained by dynamic light scattering showed that liposomes incorporating triterpenes were smaller than empty liposomes. The images obtained by transmission electron microscopy confirmed the formation of spherical vesicles. Measurements of vesicles dimensions by atomic force microscopy (AFM) demonstrated that liposomes incorporating cucurbitacin E were higher and more resistant to the force exerted by the AFM tip than the blank liposomes. Liposomes incorporating erythrodiol were more fragile and tend to break up into lipid bilayers on the mica surface. Results obtained by differential scanning calorimetry suggested that cucurbitacin E is localized at the polar-apolar interface of the liposomal membrane while erythrodiol is inserted between the acyl chains of the phospholipids leading to the formation of heterogeneous lipid domains. The release kinetics of the sulforhodamin B encapsulated into the aqueous phase and measured by fluorescence spectroscopy revealed that the liposomal membrane becomes in the presence of cucurbitacin E, more permeable to this probe. The overall results suggest that cucurbitacin E and erythrodiol affect differently