Avant d'être libéré dans la fente synaptique, le glutamate est accumulé dans les vésicules présynaptiques par les transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUTs). Il existe 3 types de VGLUTs. VGLUT3 possède une distribution anatomique et des fonctions atypiques. Au sein du système nerveux central, VGLUT3 est exprimé dans des neurones glutamatergiques mais aussi non glutamatergiques, dans lesquels il assure les fonctions de co-transmission ou de synergie vésiculaire. On le retrouve notamment dans certains neurones sérotoninergiques du raphé. Au sein de l'oreille interne, VGLUT3 est l'unique VGLUT décrit dans les cellules ciliées internes (CCI). La sérotonine joue un rôle essentiel dans le contrôle respiratoire néonatal. En étudiant la respiration de souriceaux n'exprimant plus le VGLUT3, nous avons démontré le rôle de VGLUT3 dans l'adaptation au stress hypoxique néonatal. Une mutation de VGLUT3 a été mise en évidence dans une surdité humaine très proche cliniquement de la presbyacousie et appelée DFNA25. En étudiant le phénotype auditif de souris exprimant cette mutation, nous avons prouvé l'implication de cette mutation dans l'atteinte des CCI à l'origine de la surdité DFNA25. L'étude des processus biochimiques mis en jeu nous a permis d'envisager un rôle indirect de VGLUT3 dans l'activation de la mort autophagique, via la protéine Becline 1 et une possible interaction au sein de la voie de la Culline 3. L'ensemble de ce travail nous a permis de mettre en évidence un rôle de VGLUT3 dans l'adaptation aux conditions extrêmes telles que le développement néonatal ou le processus de vieillissement. Il ouvre de nouvelles perspectives sur les diverses fonctions des VGLUTs. / Before its release into synaptic cleft, glutamate is accumulated in presynaptic vesicles by vesicular glutamate transporters (VGLUTs). There are 3 types of VGLUTs. VGLUT3 presents atypical functions and anatomical distribution. In the central nervous system, VGLUT3 is expressed in glutamatergic and non glutamatergic neurons, in which it performs the co-transmission and the vesicular synergy. Particularly, we can observe VGLUT3 in serotoninergic neurons of raphe. In the inner ear, VGLUT3 is the unique VGLUT described in the inner hair cells (IHCs). Serotonin plays a key role in the neonatal respiratory control. By exploring the respiration of VGLUT3 knock out mice pumps, we have demonstrated the role of VGLUT3 in the response to neonatal hypoxic stress. One VGLUT3 mutation has been described in a human deafness clinically very close to presbycusis, the DFNA25 deafness. By studying the auditory phenotype of mice expressing this VGLUT3 mutation, we have proved the implication of this mutation in the IHCs impairment at the origin of DFNA25 deafness. Biochemical analysis have helped us to consider an indirect role of VGLUT3 in the autophagic death. Beclin 1 and a possible interaction between VGLUT3 and the Cullin3 pathways could be implicated. All of our results allowed us to highlight a role of VGLUT3 in the adaptation to extreme conditions like neonatal development or aging process. They open new perspectives on the various functions of VGLUTs.

L’hypertension artérielle est une maladie induite par de multiples facteurs génétiques et environnementaux. De nombreuses pathologies y sont associées. A travers ce travail, j’ai abordé trois aspects de la régulation de la pression artérielle in vivo et in vitro. Dans une première partie, j’ai étudié le rôle de l’activation du récepteur AT1 de l’angiotensine II dans le développement de la fibrose, indépendamment de l’hypertension artérielle. Un modèle animal exprimant un récepteur constitutivement actif et des modèles cellulaires (MEF, HEK293, H295) exprimant le récepteur constitutivement actif de façon inductible ont été utilisés. Contrairement aux souris sur fond mixte, les souris mutées sur fond pur C57Bl6 ne développent pas de fibrose cardiaque et rénale et ont une hypertension modérée, qui est difficile à réduire par les anti-hypertenseurs. De plus, les cellules fibroblastiques MEF ne sont pas un bon modèle pour étudier la fibrose induite par l’angiotensine II. Seule l’ostéopontine est un marqueur induit par l’expression du récepteur AT1 contitutivement actif. Ces différents modèles, étudiés extensivement, ne sont donc pas adaptés pour répondre aux questions posées. Dans la seconde partie de ma thèse, un travail collaboratif a permis de mettre en évidence le rôle majeur de Wnk1 au cours de l’hypertension et du remodelage cardiovasculaire induits par une infusion chronique d’angiotensine II. En effet, les souris Wnk1+/- (haplo-insuffisantes pour le gène Wnk1) présentent une résistance transitoire à l’hypertension induite par l’angiotensine II, particulièrement au cours de la première semaine d’infusion. Cette résistance est associée à une altération du remodelage hypertrophique cardiovasculaire mais la fonction rénale et la sécrétion d’aldostérone sont préservées. Au niveau mécanistique, nos résultats ont identifié Wnk1 comme un activateur important de la phosphorylation de Mypt1, un marqueur connu de l’activité de la voie Rho-kinase. Les aortes de souris Wnk1+/- présentent une diminution transitoire de la phosphorylation de Mypt1 après une semaine d’infusion d’angiotensine II. De façon importante, nous montrons aussi que l’infusion chronique d’angiotensine II induit une activation de l’expression du gène Wnk1 au niveau aortique, et la surexpression de Wnk1 in vitro active de façon importante et reproductible la phosphorylation de Mypt1, indépendamment de l’activation de Spak (substrat bien caractérisé de Wnk1). En conclusion, ce travail a permis d’identifier Wnk1 comme un nouveau gène cible de l’angiotensine II au niveau vasculaire et a révélé un nouveau mécanisme mis en jeu au cours de l’hypertension et du remodelage cardiovasculaire qui lui est associé. Cette étude fait l’objet d’un article que je signe en premier auteur et qui est actuellement soumis pour publication. Dans une dernière partie, j’ai étudié le rôle de la culline3 dans la régulationde la voie RhoKinase. Les mutations du gène Cul3 ont très récemment été identifiées comme responsables du syndrome de Gordon. Ce gène code une protéine d’échafaudage d’un complexe d’ubiquitination important et ubiquitaire (CRL3) conduisant à la dégradation protéique. La voie des Rho-kinases joue un rôle majeur dans le tonus vasculaire et sa régulation par les agents relaxants ou constricteurs. Des travauxrécents suggèrent que la dégradation de RhoA implique le complexe culline3-ring-ligase (CRL3). Nous avons voulu établir les liens structuraux et fonctionnels entre ce complexe d’ubiquitination et la voie Rho-kinase dans des modèles cellulaires, pour ainsi expliquer tout ou partie du mécanisme moléculaire conduisant des mutations constitutionnelles du gène Cul3 à produire une hypertension artérielle. Les interactions protéiques entre deux adaptateurs différents et la culline3 nous ont permis de montrer que la culline3 mutée entraine une modification d’affinité spécifique selon ses partenaires. Les interactions entre RhoA et le CRL3 n’ont pas pu être démontré. (...) / Hypertension is a disease due to multiple genetic and environmental factors. Many cardiovascular diseases are associated. During my PhD thesis, I addressed three aspects of the regulation of blood pressure in vivo and in vitro. In the first part, I studied the role of angiotensin II AT1 receptor activation in the development of fibrosis, independently of hypertension. I used animal and cellular models (MEF, HEK293, H295) expressing a constitutively active receptor. The results show that the mutant mice did not develop cardiac or renal fibrosis in a pure C57Bl6 strain. Furthermore, their moderate hypertension has not been normalized with two antihypertensives. The pure C57BL6 genetic background seems to be the cause of this moderate phenotype. Furthermore, MEF cells are not a good model to study fibrosis induced by angiotensin II. Only osteopontin is a marker induced by expression of the mutant receptor. As the mouse models and despite of their originality, these cellular models appear to be inappropriate to study AngII-dependent fibrosis. These limitations together with the weakness of the AT1 mutant phenotype lead to us to stop this project. In the second part of my thesis, a collaborative study allows us to show that Wnk1-haploinsufficiency in mice is responsible for a strong and transitory resistance to angiotensin II (AngII)-induced hypertension associated with a significant reduction of cardiovascular remodeling and a preservation of renal function and aldosterone release. Mechanistically, we unravel a critical role for Wnk1 in the activation of the phosphorylation of Mypt1, a known marker of the Rho-kinase pathway activity. Wnk1-haploinsufficient mice display a significant and transitory decrease of AngII-induced phospho- Mypt1 in the aorta, concomitant to the hypertension-resistance. Importantly, we further evidence that, in the vasculature, AngII chronic infusion induces a significant upregulation in Wnk1 gene expression which causes in vitro a significant increase in Mypt1 phosphorylation independently of spak activation. Our results provide new insight into the downstream vascular signaling pathway of AngII and unravel a previously unsuspected mechanism linking Wnk1 to hypertension and vascular remodeling. In the last part, I studied the role of vascular Cullin3 (Cul3) in the development of hypertension. Mutations in this gene have been recently identified as responsible for a familial hypertension with hyperkalaemia, FHHt. The Cul3 gene encodes an important and ubiquitous ubiquitin scaffold protein participating to a protein degradation complex (CRL3). The Rho-kinase pathway plays a major role in vascular tone and its regulation by relaxing or vasoconstricting agents. Recent studies suggest that the degradation of RhoA involves the CRL3 complex. I started to analyze the structural and functional links between this ubiquitination complex and the Rho kinase pathway in cellular models to explain all or part of the molecular mechanisms leading constitutional mutations of Cul3 gene to produce hypertension. I have shown that the Cul3Δ9 mutant presents an increased neddylation compared to the wild form and mofications of its affinity for some adaptors. However, in this preliminary work, its interactions with and its role in the degradation of RhoA have not been demonstrated yet. This PhD thesis has helped to address several aspects of the pathophysiology of the vessels and the role of angiotensin II in these regulations using modern tools, original mouse and cell line models. This has particularly highlighted a new target of angiotensin II and a new WNK1 vascular role.