The voltage-gated potassium channel Kv1.2 impacts membrane potential and therefore excitability of neurons. Expression of Kv1.2 at the plasma membrane (PM) is critical for channel function, and altering Kv1.2 at the PM is one way to affect membrane excitability. Such is the case in the cerebellum, a portion of the brain with dense Kv1.2 expression, where modulation of Kv1.2 at the PM can impact electrical activity of neurons and ultimately cerebellum-dependent learning. Modulation of Kv1.2 at the PM can occur through endocytic trafficking of the channel; however mechanisms behind this process in the brain remain to be defined. The goal of this dissertation was to identify and characterize modalities endogenous to the brain that influence the presence of Kv1.2 at the neuronal plasma membrane. Mass spectrometry (MS) was used to first identify interacting proteins and post-translational modifications (PTM) of Kv1.2 from cerebellar tissue, and the roles of these interactions and modifications on Kv1.2 function were evaluated in two studies: The first study investigated Trim32, a protein enzyme that catalyzes ubiquitylation, a PTM involved in protein degradation, but also in non-degradative events such as endocytic trafficking. Trim32 was demonstrated to associate and localize with Kv1.2 in cerebellar neurons by MS, immunoblotting (IB), and immunofluorescence (IF), and also demonstrated the ability to ubiquitylate Kv1.2 in vitro through purified recombinant proteins. Utilizing cultured cells through a combination of mutagenesis, biochemistry, and quantitative MS, a working model of Kv1.2 modulation was developed in which Trim32 influences Kv1.2 surface expression by two mechanisms that both involve cross-talk of ubiquitylation and phosphorylation sites of Kv1.2. The second study investigated WNK1, a chloride-sensitive kinase which regulates cellular homeostasis. Using MS, IB, and IF, WNK1 was demonstrated to associate and localize with Kv1.2 in the cerebellum, and a combination of mutagenesis and pharmacology in both wild-type and WNK1-knockout cultured cells produced a working model whereby WNK1 modulates surface Kv1.2. Activation of the downstream target SPAK kinase, also identified by MS to associate with Kv1.2 in the brain, by WNK1 was additionally found to influence the manner of WNK1 modulation of Kv1.2. In addition to providing new models of Kv1.2 modulation in the brain, these studies propose novel biological roles for Trim32 and WNK1 that may ultimately impact neuronal excitability.

L’hypertension artérielle est une maladie induite par de multiples facteurs génétiques et environnementaux. De nombreuses pathologies y sont associées. A travers ce travail, j’ai abordé trois aspects de la régulation de la pression artérielle in vivo et in vitro. Dans une première partie, j’ai étudié le rôle de l’activation du récepteur AT1 de l’angiotensine II dans le développement de la fibrose, indépendamment de l’hypertension artérielle. Un modèle animal exprimant un récepteur constitutivement actif et des modèles cellulaires (MEF, HEK293, H295) exprimant le récepteur constitutivement actif de façon inductible ont été utilisés. Contrairement aux souris sur fond mixte, les souris mutées sur fond pur C57Bl6 ne développent pas de fibrose cardiaque et rénale et ont une hypertension modérée, qui est difficile à réduire par les anti-hypertenseurs. De plus, les cellules fibroblastiques MEF ne sont pas un bon modèle pour étudier la fibrose induite par l’angiotensine II. Seule l’ostéopontine est un marqueur induit par l’expression du récepteur AT1 contitutivement actif. Ces différents modèles, étudiés extensivement, ne sont donc pas adaptés pour répondre aux questions posées. Dans la seconde partie de ma thèse, un travail collaboratif a permis de mettre en évidence le rôle majeur de Wnk1 au cours de l’hypertension et du remodelage cardiovasculaire induits par une infusion chronique d’angiotensine II. En effet, les souris Wnk1+/- (haplo-insuffisantes pour le gène Wnk1) présentent une résistance transitoire à l’hypertension induite par l’angiotensine II, particulièrement au cours de la première semaine d’infusion. Cette résistance est associée à une altération du remodelage hypertrophique cardiovasculaire mais la fonction rénale et la sécrétion d’aldostérone sont préservées. Au niveau mécanistique, nos résultats ont identifié Wnk1 comme un activateur important de la phosphorylation de Mypt1, un marqueur connu de l’activité de la voie Rho-kinase. Les aortes de souris Wnk1+/- présentent une diminution transitoire de la phosphorylation de Mypt1 après une semaine d’infusion d’angiotensine II. De façon importante, nous montrons aussi que l’infusion chronique d’angiotensine II induit une activation de l’expression du gène Wnk1 au niveau aortique, et la surexpression de Wnk1 in vitro active de façon importante et reproductible la phosphorylation de Mypt1, indépendamment de l’activation de Spak (substrat bien caractérisé de Wnk1). En conclusion, ce travail a permis d’identifier Wnk1 comme un nouveau gène cible de l’angiotensine II au niveau vasculaire et a révélé un nouveau mécanisme mis en jeu au cours de l’hypertension et du remodelage cardiovasculaire qui lui est associé. Cette étude fait l’objet d’un article que je signe en premier auteur et qui est actuellement soumis pour publication. Dans une dernière partie, j’ai étudié le rôle de la culline3 dans la régulationde la voie RhoKinase. Les mutations du gène Cul3 ont très récemment été identifiées comme responsables du syndrome de Gordon. Ce gène code une protéine d’échafaudage d’un complexe d’ubiquitination important et ubiquitaire (CRL3) conduisant à la dégradation protéique. La voie des Rho-kinases joue un rôle majeur dans le tonus vasculaire et sa régulation par les agents relaxants ou constricteurs. Des travauxrécents suggèrent que la dégradation de RhoA implique le complexe culline3-ring-ligase (CRL3). Nous avons voulu établir les liens structuraux et fonctionnels entre ce complexe d’ubiquitination et la voie Rho-kinase dans des modèles cellulaires, pour ainsi expliquer tout ou partie du mécanisme moléculaire conduisant des mutations constitutionnelles du gène Cul3 à produire une hypertension artérielle. Les interactions protéiques entre deux adaptateurs différents et la culline3 nous ont permis de montrer que la culline3 mutée entraine une modification d’affinité spécifique selon ses partenaires. Les interactions entre RhoA et le CRL3 n’ont pas pu être démontré. (...) / Hypertension is a disease due to multiple genetic and environmental factors. Many cardiovascular diseases are associated. During my PhD thesis, I addressed three aspects of the regulation of blood pressure in vivo and in vitro. In the first part, I studied the role of angiotensin II AT1 receptor activation in the development of fibrosis, independently of hypertension. I used animal and cellular models (MEF, HEK293, H295) expressing a constitutively active receptor. The results show that the mutant mice did not develop cardiac or renal fibrosis in a pure C57Bl6 strain. Furthermore, their moderate hypertension has not been normalized with two antihypertensives. The pure C57BL6 genetic background seems to be the cause of this moderate phenotype. Furthermore, MEF cells are not a good model to study fibrosis induced by angiotensin II. Only osteopontin is a marker induced by expression of the mutant receptor. As the mouse models and despite of their originality, these cellular models appear to be inappropriate to study AngII-dependent fibrosis. These limitations together with the weakness of the AT1 mutant phenotype lead to us to stop this project. In the second part of my thesis, a collaborative study allows us to show that Wnk1-haploinsufficiency in mice is responsible for a strong and transitory resistance to angiotensin II (AngII)-induced hypertension associated with a significant reduction of cardiovascular remodeling and a preservation of renal function and aldosterone release. Mechanistically, we unravel a critical role for Wnk1 in the activation of the phosphorylation of Mypt1, a known marker of the Rho-kinase pathway activity. Wnk1-haploinsufficient mice display a significant and transitory decrease of AngII-induced phospho- Mypt1 in the aorta, concomitant to the hypertension-resistance. Importantly, we further evidence that, in the vasculature, AngII chronic infusion induces a significant upregulation in Wnk1 gene expression which causes in vitro a significant increase in Mypt1 phosphorylation independently of spak activation. Our results provide new insight into the downstream vascular signaling pathway of AngII and unravel a previously unsuspected mechanism linking Wnk1 to hypertension and vascular remodeling. In the last part, I studied the role of vascular Cullin3 (Cul3) in the development of hypertension. Mutations in this gene have been recently identified as responsible for a familial hypertension with hyperkalaemia, FHHt. The Cul3 gene encodes an important and ubiquitous ubiquitin scaffold protein participating to a protein degradation complex (CRL3). The Rho-kinase pathway plays a major role in vascular tone and its regulation by relaxing or vasoconstricting agents. Recent studies suggest that the degradation of RhoA involves the CRL3 complex. I started to analyze the structural and functional links between this ubiquitination complex and the Rho kinase pathway in cellular models to explain all or part of the molecular mechanisms leading constitutional mutations of Cul3 gene to produce hypertension. I have shown that the Cul3Δ9 mutant presents an increased neddylation compared to the wild form and mofications of its affinity for some adaptors. However, in this preliminary work, its interactions with and its role in the degradation of RhoA have not been demonstrated yet. This PhD thesis has helped to address several aspects of the pathophysiology of the vessels and the role of angiotensin II in these regulations using modern tools, original mouse and cell line models. This has particularly highlighted a new target of angiotensin II and a new WNK1 vascular role.

Des mutations du gène codant la serine-thréonine kinase WNK1 sont responsables de l'Hypertension Hyperkaliémique Familiale (HHF), une forme rare d'hypertension associée à une hyperkaliémie et une acidose métabolique hyperchlorémique. WNK1 donne naissance à une isoforme ubiquitaire, L-WNK1, et à une isoforme dépourvue de domaine kinase fonctionnel et exprimée exclusivement dans le néphron, KS-WNK1. Plusieurs autres isoformes sont générées par un mécanisme d'épissage alternatif mais n'ont jamais été étudiées en détail. Nous avons tout d'abord établi une description exhaustive de l'ensemble des isoformes de WNK1 et quantifié leurs niveaux d'expression respectifs dans un panel de tissus humains et murins ainsi que dans les différents segments du néphron. Nous avons ainsi montré que 9 exons de WNK1 sont soumis à épissage alternatif, ce de manière tissu-spécifique. Dans un second temps, afin de comprendre la physiopathologie de l'HHF, et de ce fait le rôle de WNK1 dans la régulation de la pression artérielle et de l'homéostasie ionique, nous avons généré des souris WNK1+/FHHt, porteuses d'une délétion du premier intron de WNK1, donc de la mutation HHF humaine. Les souris ont une pression artérielle augmentée, une hyperkaliémie et une acidose métabolique hyperchlorémique. Nous avons montré que ce phénotype provient d'une activation du co-transporteur sodium-chlore NCC secondaire à la surexpression de L-WNK1 dans le néphron distal. En conclusion, ce travail a permis d'établir une description détaillée de toutes les isoformes de WNK1 et de leur profil d'expression et de mieux comprendre la physiopathologie de l'HHF par mutation de WNK1

Les glioblastomes (GBM) sont les formes les plus agressives de tumeurs gliales avec une survie médiane des patients traités n’excédant pas 2 ans. Ce mauvais pronostic est dû, entre autres, à l’hétérogénéité de ces tumeurs avec la présence de cellules souches cancéreuses (CSCs) en prolifération ou quiescentes, particulièrement résistantes aux traitements conventionnels. Cibler ces cellules au sein du microenvironment tumoral hypoxique et acides fait donc partie des thérapies d’avenir des GBMs. Le laxatif bisacodyl a été identifié par criblage de la chimiothèque Prestwick comme un composé induisant la mort par nécrose des CSCs de glioblastome (GSCs en prolifération et en quiescence), uniquement dans des conditions de faible acidité retrouvées également au sein des tumeurs. Une activité antitumorale in vivo a également été démontrée pour ce composé. Cette thèse présente l’identification du mode d’action du bisacodyl dans les GSCs. Celui-ci implique la serine/thréonine kinase WNK1 et ses partenaires, les kinases Akt et SGK1 et des co-transporteurs Na+/HCO3- NBC. Nos résultats ont également révélé un rôle de WNK1 dans la physiopathologie des GSCs. / Glioblastoma (GBM), the most aggressive glial tumor, is currently incurable with a very short-term patient survival (< 2 years). The heterogeneity of GBM and the presence of highly resistant proliferating and quiescent cancer stem-like cells (CSCs), is largely responsible for poor prognosis in this disease. Thus, new approaches targeting glioblastoma CSCs (GSCs), within the acidic/hypoxic tumor microenvironment, are promising strategies for treating GBM. The laxative bisacodyl was identified in a high throughput screening of the Prestwick chemical library as a compound inducing necrotic cell death in proliferating and quiescent GSCs only in acidic microenvironments similar to those found in tumors. Bisacodyl was further shown to induce tumor shrinking and to increase survival in in vivo GBM models. In this thesis work, we identify bisacodyl’s mechanism of action in GSCs. This mechanism involves the serine/threonine kinase WNK1 and its signaling partners including protein kinases Akt and SGK1 and NBC Na+/HCO3- cotransporters. Our data also highlight a previously unknown role of WNK1 in GSC physiopathology.

La neuropathie humaine sensitive et autonome de type 2 (NHSA 2) est une pathologie héréditaire rare caractérisée par une apparition précoce des symptômes et une absence d’affectation motrice. Cette pathologie entraîne la perte de perception de la douleur, de la chaleur et du froid ainsi que de la pression (toucher) dans les membres supérieurs et inférieurs et est due à des mutations autosomales récessives confinées à l’exon HSN2 de la protéine kinase à sérine/thréonine WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1). Cet exon spécifique permettrait de conférer une spécificité au système nerveux à l’isoforme protéique WNK1/HSN2. La kinase WNK1 est étudiée en détails, en particulier au niveau du rein, mais son rôle au sein du système nerveux demeure inconnu. Considérant le début précoce de la neuropathie et le manque d’innervation sensorielle révélé par des biopsies chez les patients NHSA2, notre hypothèse de recherche est que les mutations tronquantes menant à la NHSA de type 2 causent une perte de fonction de l’isoforme WNK1/HSN2 spécifique au système nerveux entraînant un défaut dans le développement du système nerveux sensoriel périphérique. Chez l’embryon du poisson zèbre, WNK1/HSN2 est exprimé au niveau des neuromastes de la ligne latérale postérieure, un système mécanosensoriel périphérique. Nous avons obtenu des embryons knockdown pour WNK1/HSN2 par usage d’oligonucléotides morpholino antisens (AMO). Nos trois approches AMO ont révélé des embryons présentant des défauts d’établissement au niveau de la ligne latérale postérieure. Afin de déterminer la voie pathogène impliquant l’isoforme WNK1/HSN2, nous nous sommes intéressés à l’interaction rapportée entre la kinase WNK1 et le co-transporteur neuronal KCC2. Ce dernier est une cible de phosphorylation de WNK1 et son rôle dans la promotion de la neurogenèse est bien connu. Nous avons détecté l’expression de KCC2 au niveau de neuromastes de la ligne latérale postérieure et observé une expression accrue de KCC2 chez les embryons knockdown pour WNK1/HSN2 à l’aide de RT-PCR semi-quantitative. De plus, une sur-expression d’ARN humain de KCC2 chez des embryons a produit des défauts dans la ligne latérale postérieure, phénocopiant le knockdown de WNK1/HSN2. Ces résultats furent validés par un double knockdown, produisant des embryons n’exprimant ni KCC2, ni WNK1/HSN2, dont le phénotype fut atténué. Ces résultats nous mènent à suggérer une voie de signalisation où WNK1/HSN2 est en amont de KCC2, régulant son activation, et possiblement son expression. Nous proposons donc que la perte de fonction de l’isoforme spécifique cause un débalancement dans les niveaux de KCC2 activée, menant à une prolifération et une différenciation réduites des progéniteurs neuronaux du système nerveux périphérique. Les défauts associés à la NHSA de type 2 seraient donc de nature développementale et non neurodégénérative. / Human sensory and autonomic neuropathy type 2 (HSNA2) is a rare human hereditary pathology characterized by an early onset severe sensory loss (for all modalities) in the distal limbs. It is due to autosomal recessive mutations confined to exon HSN2 of the WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1) serine-threonine kinase; the specific exon confers nervous system specificity to target isoform WNK1/HSN2. While this kinase is widely studied in the kidneys, little is known about its role in the nervous system. Due to its role in HSAN type 2, we hypothesized that the truncating mutations present in the HSN2 exon lead to a loss-of-function of the WNK1 kinase, impairing development of the peripheral sensory system. In order to investigate the mechanisms by which the lack of the WNK1/HSN2 isoform acts to cause HSAN type 2, we examined its expression pattern in our zebrafish model and observed strong expression in neuromasts of the peripheral sensory lateral line system. We then knocked down the HSN2 exon in zebrafish embryos using antisense morpholino oligonucleotides. Our three approaches to knockdown the WNK1/HSN2 isoform led to embryos with a defective lateral line. In order to establish a pathogenic pathway involving the WNK1/HSN2 isoform, we investigated the reported interaction between the WNK1 kinase and neuronal potassium chloride co-transporter KCC2. This transporter is a target of WNK1 phosphorylation and also has a known role in promoting neurogenesis. We have also showed its expression in mature neuromasts of the posterior lateral line, and observed an increased expression of KCC2 in WNK1/HSN2 knockdown embryos by semi-quantitative RT-PCR, lending credence to our interaction hypothesis. Furthermore, overexpression of human KCC2 RNA in embryos led to an impaired mechanosensory lateral line system, phenocopying the WNK1/HSN2 knockdown. We then validated these results by obtaining double knockdown embryos, both for WNK1/HSN2 and KCC2, which alleviated the lateral line defect phenotype. These results led us to suggest a pathway in which WNK1/HSN2 is upstream of the KCC2 co-transporter. WNK1 is believed to regulate the level of activation, and possibly level of expression, of KCC2 and we therefore hypothesize that the loss-of-function of the specific isoform causes an imbalance in the levels of activated KCC2. This would then lead to decreased progenitor proliferation and hindered differentiation of neurons, causing the defects associated with HSAN type 2.

La neuropathie humaine sensitive et autonome de type 2 (NHSA 2) est une pathologie héréditaire rare caractérisée par une apparition précoce des symptômes et une absence d’affectation motrice. Cette pathologie entraîne la perte de perception de la douleur, de la chaleur et du froid ainsi que de la pression (toucher) dans les membres supérieurs et inférieurs et est due à des mutations autosomales récessives confinées à l’exon HSN2 de la protéine kinase à sérine/thréonine WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1). Cet exon spécifique permettrait de conférer une spécificité au système nerveux à l’isoforme protéique WNK1/HSN2. La kinase WNK1 est étudiée en détails, en particulier au niveau du rein, mais son rôle au sein du système nerveux demeure inconnu. Considérant le début précoce de la neuropathie et le manque d’innervation sensorielle révélé par des biopsies chez les patients NHSA2, notre hypothèse de recherche est que les mutations tronquantes menant à la NHSA de type 2 causent une perte de fonction de l’isoforme WNK1/HSN2 spécifique au système nerveux entraînant un défaut dans le développement du système nerveux sensoriel périphérique. Chez l’embryon du poisson zèbre, WNK1/HSN2 est exprimé au niveau des neuromastes de la ligne latérale postérieure, un système mécanosensoriel périphérique. Nous avons obtenu des embryons knockdown pour WNK1/HSN2 par usage d’oligonucléotides morpholino antisens (AMO). Nos trois approches AMO ont révélé des embryons présentant des défauts d’établissement au niveau de la ligne latérale postérieure. Afin de déterminer la voie pathogène impliquant l’isoforme WNK1/HSN2, nous nous sommes intéressés à l’interaction rapportée entre la kinase WNK1 et le co-transporteur neuronal KCC2. Ce dernier est une cible de phosphorylation de WNK1 et son rôle dans la promotion de la neurogenèse est bien connu. Nous avons détecté l’expression de KCC2 au niveau de neuromastes de la ligne latérale postérieure et observé une expression accrue de KCC2 chez les embryons knockdown pour WNK1/HSN2 à l’aide de RT-PCR semi-quantitative. De plus, une sur-expression d’ARN humain de KCC2 chez des embryons a produit des défauts dans la ligne latérale postérieure, phénocopiant le knockdown de WNK1/HSN2. Ces résultats furent validés par un double knockdown, produisant des embryons n’exprimant ni KCC2, ni WNK1/HSN2, dont le phénotype fut atténué. Ces résultats nous mènent à suggérer une voie de signalisation où WNK1/HSN2 est en amont de KCC2, régulant son activation, et possiblement son expression. Nous proposons donc que la perte de fonction de l’isoforme spécifique cause un débalancement dans les niveaux de KCC2 activée, menant à une prolifération et une différenciation réduites des progéniteurs neuronaux du système nerveux périphérique. Les défauts associés à la NHSA de type 2 seraient donc de nature développementale et non neurodégénérative. / Human sensory and autonomic neuropathy type 2 (HSNA2) is a rare human hereditary pathology characterized by an early onset severe sensory loss (for all modalities) in the distal limbs. It is due to autosomal recessive mutations confined to exon HSN2 of the WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1) serine-threonine kinase; the specific exon confers nervous system specificity to target isoform WNK1/HSN2. While this kinase is widely studied in the kidneys, little is known about its role in the nervous system. Due to its role in HSAN type 2, we hypothesized that the truncating mutations present in the HSN2 exon lead to a loss-of-function of the WNK1 kinase, impairing development of the peripheral sensory system. In order to investigate the mechanisms by which the lack of the WNK1/HSN2 isoform acts to cause HSAN type 2, we examined its expression pattern in our zebrafish model and observed strong expression in neuromasts of the peripheral sensory lateral line system. We then knocked down the HSN2 exon in zebrafish embryos using antisense morpholino oligonucleotides. Our three approaches to knockdown the WNK1/HSN2 isoform led to embryos with a defective lateral line. In order to establish a pathogenic pathway involving the WNK1/HSN2 isoform, we investigated the reported interaction between the WNK1 kinase and neuronal potassium chloride co-transporter KCC2. This transporter is a target of WNK1 phosphorylation and also has a known role in promoting neurogenesis. We have also showed its expression in mature neuromasts of the posterior lateral line, and observed an increased expression of KCC2 in WNK1/HSN2 knockdown embryos by semi-quantitative RT-PCR, lending credence to our interaction hypothesis. Furthermore, overexpression of human KCC2 RNA in embryos led to an impaired mechanosensory lateral line system, phenocopying the WNK1/HSN2 knockdown. We then validated these results by obtaining double knockdown embryos, both for WNK1/HSN2 and KCC2, which alleviated the lateral line defect phenotype. These results led us to suggest a pathway in which WNK1/HSN2 is upstream of the KCC2 co-transporter. WNK1 is believed to regulate the level of activation, and possibly level of expression, of KCC2 and we therefore hypothesize that the loss-of-function of the specific isoform causes an imbalance in the levels of activated KCC2. This would then lead to decreased progenitor proliferation and hindered differentiation of neurons, causing the defects associated with HSAN type 2.