Des mutations du gène codant la serine-thréonine kinase WNK1 sont responsables de l'Hypertension Hyperkaliémique Familiale (HHF), une forme rare d'hypertension associée à une hyperkaliémie et une acidose métabolique hyperchlorémique. WNK1 donne naissance à une isoforme ubiquitaire, L-WNK1, et à une isoforme dépourvue de domaine kinase fonctionnel et exprimée exclusivement dans le néphron, KS-WNK1. Plusieurs autres isoformes sont générées par un mécanisme d'épissage alternatif mais n'ont jamais été étudiées en détail. Nous avons tout d'abord établi une description exhaustive de l'ensemble des isoformes de WNK1 et quantifié leurs niveaux d'expression respectifs dans un panel de tissus humains et murins ainsi que dans les différents segments du néphron. Nous avons ainsi montré que 9 exons de WNK1 sont soumis à épissage alternatif, ce de manière tissu-spécifique. Dans un second temps, afin de comprendre la physiopathologie de l'HHF, et de ce fait le rôle de WNK1 dans la régulation de la pression artérielle et de l'homéostasie ionique, nous avons généré des souris WNK1+/FHHt, porteuses d'une délétion du premier intron de WNK1, donc de la mutation HHF humaine. Les souris ont une pression artérielle augmentée, une hyperkaliémie et une acidose métabolique hyperchlorémique. Nous avons montré que ce phénotype provient d'une activation du co-transporteur sodium-chlore NCC secondaire à la surexpression de L-WNK1 dans le néphron distal. En conclusion, ce travail a permis d'établir une description détaillée de toutes les isoformes de WNK1 et de leur profil d'expression et de mieux comprendre la physiopathologie de l'HHF par mutation de WNK1

Un canal chlorure de 10 pS de la membrane basolatérale des cellules intercalaires du canal connecteur présente des propriétés proches de celles de ClC-K2. Nos données de patch clamp montrent que son activité et le nombre de canaux actifs (N) augmentent avec (i) la dépolarisation membranaire (ii) la concentration en calcium externe et (iii) l’alcalinisation extra et intracellulaire. L’alcalinisation extracellulaire déplace la dépendance au voltage vers des potentiels négatifs, alors que l’alcalinisation intracellulaire augmente leur activité à des potentiels négatifs. Ces données suggèrent que le Ca2+ extracellulaire et le pH modulent l’activité des canaux ClC-K2 via une action sur la porte commune plutôt que sur les protopores des autres canaux ClC. Nous avons cherché à établir le rôle et l’identité moléculaire des canaux potassiques basolatéraux du tubule contourné proximal (PCT), peu connus. Nos résultats montrent la présence d’ARNm codant pour les sous-unités Kir4.2 et Kir5.1 dans le PCT et, par western blot et par immunohistochimie, leur expression sur la membrane basolatérale du PCT. Un canal potassique, étudié par patch-clamp, présente des propriétés semblables à celles des canaux hétérotétramériques Kir4.2/Kir5.1 sur la membrane basolatérale du PCT de souris : il présente une conductance de 47 pS, une rectification entrante induite par le Mg2+ intracellulaire, une dépendance de son activité au pHi et un blocage par le Ba2+ extracellulaire. Cependant, un phénotype rénal chez des souris invalidées pour le gène Kcnj15 codant pour Kir4.2 n’a pas pu être mis en évidence. / A 10 pS chloride channel at the basolateral side of connecting duct intercalated cells shares properties with the cloned ClC-K2 channel. Patch-clamp experiments show that its activity and the number of active channels increase with (i) membrane depolarization (ii) external calcium concentration and (iii) external and internal alkalinization. External alkalinization also shifts the voltage-dependence curve towards negative voltages while internal alkalinization flattens the voltage-dependence curve thereby raising channel activity at negative potentials. These data suggest that extracellular calcium and both extra and intracellular protons modulate ClC-K2 channels activity through an action on the common gate rather than on the protopores present in others ClC channels.The role and the molecular identity of basolateral potassium channels of the proximal convoluted tubule (PCT) are not very well known. RT-PCR results revealed the presence of mRNA encoding the Kir4.2 and Kir5.1 potassium channels subunits in mouse PCT tubular cells, and western blot and immunohistochemistry experiments showed that both proteins are expressed at the basolateral membrane of these cells. The most frequent channel observed by patch-clamp on the basolateral membrane of PCT presents a conductance of 47 pS, an inward rectification induced by intracellular Mg2+, an inhibition by extracellular Ba2+ and an activity dependent on intracellular pH. These electrophysiological properties are consistent with the presence of heteromeric Kir4.2/Kir5.1 channels in the basolateral membrane of mouse PCT. The study of mice knocked out for the Kir4.2-encoding gene Kcnj15 did not highlight a renal phenotype.

L’Hypertension Hyperkaliémique Familiale (FHHt) est une forme rare d’hypertension artérielle associée à une hyperkaliémie et une acidose métabolique hyperchlorémique. Ces troubles sont corrigés par les diurétiques thiazidiques qui inhibent le co-transporteur Na+-Cl- NCC exprimé dans le néphron distal. Cette sensibilité aux diurétiques thiazidiques a laissé́ supposer que la FHHt est causée par une activation de NCC. En 2001, des mutations, de type gain-de-fonction, responsables de la FHHt ont été découvertes dans les gènes codant les sérine-thréonine kinases WNK1 et WNK4 [With No (K) lysine]. Des études in vitro ont montré que WNK1 et WNK4 stimulent NCC de façon indirecte, via la phosphorylation et l'activation de la kinase SPAK (Ste20 like Proline-Alanine rich Kinase). In vivo, l’activation de SPAK joue un rôle central dans le développement de la FHHt due aux mutations de WNK4. L'implication de SPAK n'a pas été définie dans le cas des mutations de WNK1. Nous avons donc croisé les souris WNK1+/FHHt, porteuses d'une mutation FHHt de WNK1, avec les souris SPAK243A/243A, porteuses d’une mutation abolissant l’activation de SPAK par les WNK. L’ensemble des phénotypes observés chez les souris WNK1+/FHHt est corrigé chez les souris WNK1+/FHHt:SPAK243A/243A démontrant ainsi le rôle central de SPAK dans la FHHt causée par les mutations WNK1. En 2012, de nouvelles mutations ont été identifiées dans les gènes codant CUL3 et KLHL3, deux composants d’un complexe ubiquitine ligase. Comme les mutations de WNK1 et WNK4, ces mutations entraînent une augmentation de l’expression de WNK1 et de WNK4. De façon inattendue, les patients FHHt porteurs d'une mutation CUL3 présentent un phénotype plus sévère que les autres. Des études suggèrent que ces mutations perturbent la fonction non seulement du néphron distal mais également des artères. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons généré et comparé deux modèles de souris : les souris pgk-Cul3Δ9, exprimant la mutation Cul3 de façon ubiquitaire, comme les patients, et les souris sm22-Cul3Δ9, exprimant la mutation uniquement dans les cellules musculaires vasculaires lisses. Les deux modèles sont hypertendus, mais les souris pgk-Cul3Δ9 le sont significativement plus que les souris sm22-Cul3Δ9, ce qui prouve que l’hypertension causée par les mutations Cul3 résulte du cumul d’une atteinte rénale et vasculaire. Récemment, de nouvelles mutations faux-sens d'un domaine dit acide de WNK1 ont été identifiées dans un petit nombre de patients atteints de FHHt. Ce domaine est nécessaire à la liaison à KLHL3 et donc à l’ubiquitination des WNK. Notre étude montre que, in vitro, ces mutations entraînent une accumulation d'une seule isoforme de WNK1. Chez la souris, la mutation du domaine acide provoque le même phénotype que les patients, ainsi qu’une augmentation de la phosphorylation de SPAK et du co-transporteur NCC. Cette étude a donc permis de démontrer le rôle essentiel de ce domaine dans la régulation de l'abondance de WNK1 dans le néphron distal in vivo. En conclusion, mon travail a permis une meilleure compréhension du rôle joué par SPAK, WNK1 et CUL3 dans le développement de la FHHt et, plus largement, de la physiopathologie de la FHHt. / Familial Hyperkalemic Hypertension (FHHt) is a rare form of hypertension associated with hyperkalemia and hyperchloremic metabolic acidosis. These disorders are all corrected by thiazide diuretics that inhibit the Na+-Cl- NCC cotransporter expressed in the distal nephron. The sensitivity of FHHt patients to thiazide diuretics strongly suggested that FHHt is caused by NCC activation. In 2001, gain-of function-mutations were identified in the genes encoding the serine-threonine kinases WNK1 and WNK4 [With No (K) lysine] in a subst of FHHt patients. In vitro studies demonstrate that WNK1 and WNK4 indirectly stimulate NCC, through the phosphorylation and activation of SPAK (Ste20 like Proline-Alanine rich Kinase). In vivo, SPAK activation plays a central role in the pathogenesis of FHHt caused by WNK4 mutations. However, the implication of SPAK has never been shown for the WNK1 mutations. Thus, we crossed WNK1+/FHHt mice, bearing the WNK1-FHHt mutation, with SPAK243A/243A mice bearing a mutation abolishing SPAK activation by the WNKs. All FHHt phenotypes observed in WNK1+/FHHt were corrected in WNK1+/FHHt:SPAK243A/243A mice demonstrating the central role of SPAK in FHHt caused by WNK1 mutations. In 2012, new mutations have been identified in CUL3 and KLHL3 genes. The products of these genes are both part of a ubiquitin ligase complex. As WNK1 and WNK4 mutations, these mutations lead to an increased expression of L-WNK1 and/or WNK4. Surprisingly, patients with CUL3 mutations display a more severe phenotype. Previous studies have suggested that CUL3 could be involved not only in the regulation of ion transport in the distal nephron but also in the regulation of vascular tone. To verify this hypothesis, we generated and compared two mouse models: pgk-Cul3Δ9 mouse model bearing, as patients, an ubiquitous Cul3 mutation, and sm22-Cul3Δ9 mouse model that express the Cul3 mutation only in vascular smooth muscle cells. Both models are hypertensive, but pgk-Cul3Δ9 mice display a more severe hypertension than sm22-Cul3Δ9 mice. It demonstrates that the hypertension caused by Cul3 mutations results from both renal and vascular disorders. Recently, new missense mutations have been identified in WNK1 acidic motif in a small number of FHHt patients. This acidic motif is necessary for the liaison to KLHL3 and therefore for WNK ubiquitination. Our study shows that, in vitro, these mutations lead to the accumulation of only one isoform of WNK1. In mice, the mutation of WNK1 acidic motif leads to an increased phosphorylation of SPAK and NCC. Therefore, it demonstrates the essential role of the acidic motif in the regulation of WNK1 abundance in vivo in the distal nephron. This work contributes to a better comprehension of the role played by SPAK, WNK1 and CUL3 in FHHt and more generally in the regulation of blood pressure and Na+/K+ homeostasis.