Les cellules différenciées peuvent changer de destin cellulaire de manière induite ou naturelle. Afin de comprendre et connaître les acteurs et mécanismes contrôlant les processus de reprogrammation, notre laboratoire étudie le changement d'identité (ou transdifférenciation, Td) naturel d’une cellule épithéliale rectale (nommée Y) en motoneurone (nommé PDA) chez Caenorhabditis elegans. Les travaux préliminaires ont montré qu’il existe une synergie entre les modifications d’histone (jmjd-3.1 et wdr-5.1) et l’ubiquitination (sel-10). SEL-10 est une ubiquitine ligase E3 possédant un domaine Fbox et une répétition de domaines WD40. Dans cette étude, nous avons pu mettre en évidence : i) une implication du domaine Fbox, des indications sur la localisation intracellulaire de SEL-10 et un rôle inattendu du protéasome au sein de la Td. ii) un rôle de SEL-10 dans la robustesse de la Td (résistance aux stress environnementaux). iii) sel-10, jmjd-3.1 et wdr-5.1 agissent sur la transcription de gènes impliqués dans la transdifférenciation (testé par smFISH). Ainsi qu’une caractérisation du motif d’expression marqueur de Td cog-1 au cours de la redifférenciation. / Differentiated cells can change their cellular fate induced or naturally. In order to understand the mechanisms controlling reprogramming processes, our laboratory is studying the natural change in identity (or transdifferentiation, Td) of a rectal epithelial cell (named Y) and motor neuron (named PDA) in Caenorhabditis elegans.Preliminary work has shown that there is a synergy between histone modifications (jmjd-3.1 and wdr-5.1) and ubiquitination (sel-10). SEL-10 is an E3 ubiquitin ligase with a Fbox domain and WD40 repeat domain.In this study, we highlight: i) the Fbox domain involvement in the Td, indications about the intracellular localization of SEL-10 and an unexpected role of the proteasome within TD. ii) a role of SEL-10 in the robustness of the Td. iii) sel-10, jmjd-3.1 and wdr-5.1 act on gene transcription in transdifferentiation. This one was tested by smFISH and allowed the characterization of the cog-1 transdifferentiation marker expression pattern during redifferentiation.

L’Hypertension Hyperkaliémique Familiale (FHHt) est une forme rare d’hypertension artérielle associée à une hyperkaliémie et une acidose métabolique hyperchlorémique. Ces troubles sont corrigés par les diurétiques thiazidiques qui inhibent le co-transporteur Na+-Cl- NCC exprimé dans le néphron distal. Cette sensibilité aux diurétiques thiazidiques a laissé́ supposer que la FHHt est causée par une activation de NCC. En 2001, des mutations, de type gain-de-fonction, responsables de la FHHt ont été découvertes dans les gènes codant les sérine-thréonine kinases WNK1 et WNK4 [With No (K) lysine]. Des études in vitro ont montré que WNK1 et WNK4 stimulent NCC de façon indirecte, via la phosphorylation et l'activation de la kinase SPAK (Ste20 like Proline-Alanine rich Kinase). In vivo, l’activation de SPAK joue un rôle central dans le développement de la FHHt due aux mutations de WNK4. L'implication de SPAK n'a pas été définie dans le cas des mutations de WNK1. Nous avons donc croisé les souris WNK1+/FHHt, porteuses d'une mutation FHHt de WNK1, avec les souris SPAK243A/243A, porteuses d’une mutation abolissant l’activation de SPAK par les WNK. L’ensemble des phénotypes observés chez les souris WNK1+/FHHt est corrigé chez les souris WNK1+/FHHt:SPAK243A/243A démontrant ainsi le rôle central de SPAK dans la FHHt causée par les mutations WNK1. En 2012, de nouvelles mutations ont été identifiées dans les gènes codant CUL3 et KLHL3, deux composants d’un complexe ubiquitine ligase. Comme les mutations de WNK1 et WNK4, ces mutations entraînent une augmentation de l’expression de WNK1 et de WNK4. De façon inattendue, les patients FHHt porteurs d'une mutation CUL3 présentent un phénotype plus sévère que les autres. Des études suggèrent que ces mutations perturbent la fonction non seulement du néphron distal mais également des artères. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons généré et comparé deux modèles de souris : les souris pgk-Cul3Δ9, exprimant la mutation Cul3 de façon ubiquitaire, comme les patients, et les souris sm22-Cul3Δ9, exprimant la mutation uniquement dans les cellules musculaires vasculaires lisses. Les deux modèles sont hypertendus, mais les souris pgk-Cul3Δ9 le sont significativement plus que les souris sm22-Cul3Δ9, ce qui prouve que l’hypertension causée par les mutations Cul3 résulte du cumul d’une atteinte rénale et vasculaire. Récemment, de nouvelles mutations faux-sens d'un domaine dit acide de WNK1 ont été identifiées dans un petit nombre de patients atteints de FHHt. Ce domaine est nécessaire à la liaison à KLHL3 et donc à l’ubiquitination des WNK. Notre étude montre que, in vitro, ces mutations entraînent une accumulation d'une seule isoforme de WNK1. Chez la souris, la mutation du domaine acide provoque le même phénotype que les patients, ainsi qu’une augmentation de la phosphorylation de SPAK et du co-transporteur NCC. Cette étude a donc permis de démontrer le rôle essentiel de ce domaine dans la régulation de l'abondance de WNK1 dans le néphron distal in vivo. En conclusion, mon travail a permis une meilleure compréhension du rôle joué par SPAK, WNK1 et CUL3 dans le développement de la FHHt et, plus largement, de la physiopathologie de la FHHt. / Familial Hyperkalemic Hypertension (FHHt) is a rare form of hypertension associated with hyperkalemia and hyperchloremic metabolic acidosis. These disorders are all corrected by thiazide diuretics that inhibit the Na+-Cl- NCC cotransporter expressed in the distal nephron. The sensitivity of FHHt patients to thiazide diuretics strongly suggested that FHHt is caused by NCC activation. In 2001, gain-of function-mutations were identified in the genes encoding the serine-threonine kinases WNK1 and WNK4 [With No (K) lysine] in a subst of FHHt patients. In vitro studies demonstrate that WNK1 and WNK4 indirectly stimulate NCC, through the phosphorylation and activation of SPAK (Ste20 like Proline-Alanine rich Kinase). In vivo, SPAK activation plays a central role in the pathogenesis of FHHt caused by WNK4 mutations. However, the implication of SPAK has never been shown for the WNK1 mutations. Thus, we crossed WNK1+/FHHt mice, bearing the WNK1-FHHt mutation, with SPAK243A/243A mice bearing a mutation abolishing SPAK activation by the WNKs. All FHHt phenotypes observed in WNK1+/FHHt were corrected in WNK1+/FHHt:SPAK243A/243A mice demonstrating the central role of SPAK in FHHt caused by WNK1 mutations. In 2012, new mutations have been identified in CUL3 and KLHL3 genes. The products of these genes are both part of a ubiquitin ligase complex. As WNK1 and WNK4 mutations, these mutations lead to an increased expression of L-WNK1 and/or WNK4. Surprisingly, patients with CUL3 mutations display a more severe phenotype. Previous studies have suggested that CUL3 could be involved not only in the regulation of ion transport in the distal nephron but also in the regulation of vascular tone. To verify this hypothesis, we generated and compared two mouse models: pgk-Cul3Δ9 mouse model bearing, as patients, an ubiquitous Cul3 mutation, and sm22-Cul3Δ9 mouse model that express the Cul3 mutation only in vascular smooth muscle cells. Both models are hypertensive, but pgk-Cul3Δ9 mice display a more severe hypertension than sm22-Cul3Δ9 mice. It demonstrates that the hypertension caused by Cul3 mutations results from both renal and vascular disorders. Recently, new missense mutations have been identified in WNK1 acidic motif in a small number of FHHt patients. This acidic motif is necessary for the liaison to KLHL3 and therefore for WNK ubiquitination. Our study shows that, in vitro, these mutations lead to the accumulation of only one isoform of WNK1. In mice, the mutation of WNK1 acidic motif leads to an increased phosphorylation of SPAK and NCC. Therefore, it demonstrates the essential role of the acidic motif in the regulation of WNK1 abundance in vivo in the distal nephron. This work contributes to a better comprehension of the role played by SPAK, WNK1 and CUL3 in FHHt and more generally in the regulation of blood pressure and Na+/K+ homeostasis.

Les modifications post-traductionnelles des protéines constituent un niveau crucial de régulation de l'expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l'ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. La fixation de ce peptide de 76 acides aminés, extrêmement conservé, sous forme de chaîne de polyubiquitine, nécessite l'intervention de trois enzymes (E1, E2 et E3) et constitue un signal de dégradation de la protéine ainsi modifiée. Cette voie de régulation intervient dans de très nombreux processus biologiques. Les complexes SCF sont impliqués dans la voie de protéolyse ciblée. Ils représentent l' une des classes les plus fréquentes d'ubiquitine ligase E3 et ils sont composés de quatre sous-unités (Rbx, Cullin, SKP1, et F-box). La structure et la fonction des complexes SCF, ont été étudiées chez la levure, l'Homme et la plante modèle A. thaliana. Cependant, peu de travaux ont été réalisés chez des plantes cultivées, en particulier les céréales, telles que le blé. Cinq gènes codant pour la sous-unité Skp1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 et TSK16), cinq gènes codant pour la sous-unité F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 et ABA-T), un gène codant pour la sous-unité Cullin1 et un gène codant pour la protéine RBX du complexe SCF du blé, ont été isolés et clonés. Les différents tests d'interaction entre les quatre sous-unités du complexe SCF ont été réalisés par la méthode du double-hybride dans la levure en utilisant la technologie Gateway. Ces études ont montré que les deux protéines, TSK1 et TSK3, fixent spécifiquement différentes sous-unités F-box. Parallèlement, nous avons montré que la protéine TSK11 représente une structure particulière. Des études d'insertion/délétion sur la protéine TSK11 ont permis d'identifier un nouveau domaine indispensable à l'interaction. Les analyses par PCR semi-quantitative des différents gènes codant pour la sous-unité Skp1, dans trois tissus différents (feuille tige et racine), ont mis en évidence une expression constitutive des gènes TSK3, TSK6 et TSK11. Tandis que les gènes TSK1 et TSK16 sont exprimés préférentiellement dans les racines. Les analyses par PCR semi-quantitative sur des plantules de blé à différents stades de développement, ont mis en évidence une surexpression du gène TSK11 au moment de la floraison. Ce qui suggère que TSK11 est probablement un équivalent fonctionnel d'ASK1 chez Arabidopsis thaliana.

Les modifications post-traductionnelles des protéines constituent un niveau crucial de régulation de l’expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l’ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. La fixation de ce peptide de 76 acides aminés, extrêmement conservé, sous forme de chaîne de polyubiquitine, nécessite l’intervention de trois enzymes (E1, E2 et E3) et constitue un signal de dégradation de la protéine ainsi modifiée. Cette voie de régulation intervient dans de très nombreux processus biologiques. Les complexes SCF sont impliqués dans la voie de protéolyse ciblée. Ils représentent l' une des classes les plus fréquentes d'ubiquitine ligase E3 et ils sont composés de quatre sous-unités (Rbx, Cullin, SKP1, et F-box). La structure et la fonction des complexes SCF, ont été étudiées chez la levure, l’Homme et la plante modèle A. thaliana. Cependant, peu de travaux ont été réalisés chez des plantes cultivées, en particulier les céréales, telles que le blé. Cinq gènes codant pour la sous-unité Skp1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 et TSK16), cinq gènes codant pour la sous-unité F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 et ABA-T), un gène codant pour la sous-unité Cullin1 et un gène codant pour la protéine RBX du complexe SCF du blé, ont été isolés et clonés. Les différents tests d’interaction entre les quatre sous-unités du complexe SCF ont été réalisés par la méthode du double-hybride dans la levure en utilisant la technologie Gateway. Ces études ont montré que les deux protéines, TSK1 et TSK3, fixent spécifiquement différentes sous-unités F-box. Parallèlement, nous avons montré que la protéine TSK11 représente une structure particulière. Des études d’insertion/délétion sur la protéine TSK11 ont permis d’identifier un nouveau domaine indispensable à l’interaction. Les analyses par PCR semi-quantitative des différents gènes codant pour la sous-unité Skp1, dans trois tissus différents (feuille tige et racine), ont mis en évidence une expression constitutive des gènes TSK3, TSK6 et TSK11. Tandis que les gènes TSK1 et TSK16 sont exprimés préférentiellement dans les racines. Les analyses par PCR semi-quantitative sur des plantules de blé à différents stades de développement, ont mis en évidence une surexpression du gène TSK11 au moment de la floraison. Ce qui suggère que TSK11 est probablement un équivalent fonctionnel d’ASK1 chez Arabidopsis thaliana. / The selective degradation of proteins is an important means of regulating gene expression and plays crucial roles in the control of various cellular processes. The Ubiquitin (Ub)–Proteasome System (UPS) is the principal non-lysosomal proteolytic pathway in eukaryotic cells and is required for the degradation of key regulatory proteins. Ubiquitin is a 76-residue protein that can be attached covalently to target proteins through an enzymatic conjugation cascade involving three enzymes denoted, E1, E2 and E3.The SCF complex is a type of ubiquitin-protein ligase (E3) that acts as the specific factor responsible for substrate recognition and ubiquitination. Some polyubiquitinated proteins are then targeted to the 26S proteasome for degradation. The SCF complex consists of four components including SKP1, Cullin1, Rbx1 and a large gene family of F-box proteins. Twenty one SKP1-related genes have been described in the Arabidopsis genome and some of these genes have been analyzed genetically. By contrast, little is known about the function and structure of SKP1 homologues in wheat. Some of the Triticum SKP1-related protein (TSKs) have been characterized in this study. Five complete sequences of SKP1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 and TSK16), five F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 and ABA-T), one Cullin1 and one Rbx, were successfully cloned and biochemically characterized. Yeast two-hybrid analysis showed that TSK1 and TSK3 are capable of interacting with different F-box proteins. Furthermore, TSK11 contains an additional domain that changed its interaction capabilities. In vitro analysis using a chimeric protein showed that this additional domain could modify the interaction between a SKP-like protein and two F-box proteins. Expression analyses revealed that TSK1 and TSK16 were expressed predominantly in roots. While, TSK3, TSK6 and TSK11 were expressed in several wheat organs. In addition, the TSK11 was up-regulated in the leaves at the flowering stage.