Orientador: Paulo Cezar Ceresini / Resumo: Rhizoctonia solani AG-1 IA é um patógeno habitante do solo que causa doenças em pastagens e plantas cultivadas, em vários estados brasileiros. Para penetrar e colonizar os tecidos do hospedeiro, o microrganismo utiliza enzimas que podem ser de interesse biotecnológico e industrial. O objetivo do presente trabalho foi produzir e caracterizar a α-amilase secretada por R. solani AG-1 IA utilizando produtos e resíduos agroindustriais como substratos para fermentação. Para todos os ensaios foi adotado o processo de cultivo em estado sólio (CES) à temperatura de 25 °C e umidade inicial de 60%. Inicialmente, nove isolados de R. solani provenientes de diferentes hospedeiros (arroz, braquiária e soja) foram comparados quanto à produção amilolítica. As maiores atividades enzimáticas foram proporcionadas pelos isolados TO_022 e MT_SO85, procedentes da cultura da soja. Na etapa seguinte, foi avaliado o efeito do substrato sobre a produção enzimática. Farelo de trigo (12,98 U mL-1; TO_022), farelo de soja (3,97 U mL-1; MT_SO85) e braquiária lavada (4,95 U mL-1; TO_022) induziram eficientemente a produção amilolítica. O perfil de produção enzimática no farelo de trigo, melhor substrato avaliado no cultivo, indicou o tempo de 216 h como o mais apropriado para a obtenção de α-amilases pelo isolado TO_022 (22,14 U mL-1), e 240 h para o isolado MT_SO85 (22,84 U mL-1). Para caracterização físico-química da enzima foi utilizado o extrato enzimático bruto do isolado TO_022. A α-amilase de R. sola... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Rhizoctonia solani AG-1 IA is a soil-borne pathogen that causes diseases in pastures and cultivated plants in several Brazilian states. To penetrate and colonize host tissues, the microorganism uses enzymes that may be of biotechnological and industrial interest. The aim of the present work was to produce and characterize the α-amylase secreted by R. solani AG-1 IA using agroindustrial products and residues as substrates for fermentation. For all the tests, the solid state cultivation process (SSC) at 25 °C and initial humidity of 60% was adopted. Initially, nine isolates of R. solani from different hosts (rice, Brachiaria grass and soybean) were compared for amylolytic production. The major enzymatic activities were provided by the isolates TO_022 and MT_SO85, from the soybean crop. In the next step, the effect of the substrate on the enzymatic production was evaluated. Wheat bran (12.98 U mL-1; TO_022), soybean meal (3.97 U mL-1, MT_SO85) and washed ruzigrass (4.95 U mL-1; TO_022) efficiently induced amylolytic production. The enzymatic production profile in wheat bran, the best substrate evaluated in the culture, indicated the time of 216 h as the most appropriate to obtain α-amylases by the TO_022 isolate (22.14 U mL-1), and 240 h for the isolated MT_SO85 (22.84 U mL-1). For the physicochemical characterization of the enzyme, the crude enzymatic extract of the TO_022 isolate was used. The α-amylase of R. solani TO_022 exhibited maximum activity at 55 °C and pH 5.5, and ma... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: João Cláudio Thoméo / Resumo: Este trabalho tem como objetivo produzir esporos do fungo Metarhizium anisopliae IBCB 425 em biorreator de leito empacotado visando o aumento da escala, propondo ainda alternativas para a extração dos esporos do meio de cultivo. Também se propõe compreender a preferência do fungo pelo arroz como substrato, procurando-se alternativas para redução dos custos de produção relativos a este substrato. Para isso, realizou-se o cultivo e o reuso do substrato em embalagens plásticas, onde se observou que o cultivo em arroz tipo 1 ainda é o melhor substrato para o fungo, quando comparado com os utilizados neste trabalho sendo, quirera de arroz e farelo de arroz, porém para o aumento de escala e reuso do substrato, a melhor alternativa é a mistura de arroz com bagaço de cana-de-açúcar na proporção de 9:1. Também se realizou ensaios em biorreatores de leito empacotado de 7.62 cm e 20 cm de diâmetro, utilizando a mistura de arroz e bagaço como substrato, e observou-se que, para ambas as configurações, o bagaço evitou a compactação do leito, não se observando temperaturas elevadas que interferissem no desenvolvimento do microrganismo. Com as análises de degradação do amido e da atividade das enzimas amilase total, alfa – amilase e protease, foi possível concluir que o fungo se desenvolve de maneira distinta a cada uso dos grãos e que, o maior consumo de amido ocorre no primeiro cultivo (R1), reduzindo-o em cerca de 30%. Análises de microscopia óptica foram realizadas nos grãos cultivados, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work aimed to produce spores of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae IBCB 425 in packed-bed bioreactors targeting the scale-up, and also to propose alternatives to the extraction of the spores from the cultivation medium. The understanding of the preference of the fungus for the long rice as substrate was also verified in order to reduce the production costs associated to the rice. Therefore, the rice was cultivated in plastic packages and it was noticed that rice is still the best substrate for the fungal growth, even though for the scale-up and reutilization of the substrate it was necessary to mix it with sugarcane bagasse at a proportion 9:1 (rice:bagasse). Experiments in packed-beds of 7.62 and 20 cm internal diameter have been carried out using the mixture rice:bagasse and for both sizes no compaction was noted and no excessive temperature took place. From starch analysis and from the activities of total amylase, alpha-amylase and protease it was noticed that the microbe develops distinctly in each consecutive cultivation of rice, and that after the first cultivation (R1), the starch content was reduced by 30%. Optical microscopy of the cultivated grains revealed that during R1 the fungal hyphaes penetrated the grains, but during the second (r2) and third (R3) cultivations the fungal growth is restricted to the grain surface. It was observed a substrate mass reduction in the packed-bed experiments of 24%, 20% and 17% after R1, R2 and R3, respectively.... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

São objetivos deste trabalho: (1) avaliar a produção de celulases pelo fungo termofílico Myceliophthora sp. M77, isolado no âmbito do programa BIOTA-FAPESP, cultivando-o em meios compostos por bagaço de cana-de-açúcar (B) e farelo de trigo (T) ou farelo de soja (S), portanto, cultivos em estado sólido; (2) avaliar a eficácia das enzimas na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar e celulose cristalina. Nos cultivos em frascos Erlenmeyer, o maior valor de concentração de celulases foi obtido em meio SB (10:90) (porcentagem em massa) com 80% de umidade inicial, 10,3 FPU.gms-1 após cinco dias de cultivo, valor este 120% superior ao valor de 4,8 U.gms-1, que foi a maior concentração de celulases registrada no cultivo em meio TB (20:80) com 60% de umidade inicial. O uso de aeração forçada no cultivo de Myceliophthora sp. M77 em meio SB (10:90) com 80% de umidade inicial, em reator de leito fixo, resultou aumento de 30% na concentração de celulase e na máxima produtividade em relação aos cultivos em frasco Erlenmeyer. Ensaios de hidrólise nas temperaturas de 50°C, 60°C e 70°C foram realizados para determinação da melhor temperatura de ação das celulases produzidas pelo fungo Myceliophthora sp. M77. Utilizou-se extrato obtido a partir do cultivo de Myceliophthora sp. M77 em meio SB (10:90) com umidade inicial de 60% a 45°C por 3 dias. Após 48h de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor, a conversão de celulose a glicose foi de 15% para T=50°C, 8% para T=60°C e 1,5% para T=70°C. Os resultados indicam que pode ocorrer desnaturação térmica a 60°C e 70°C para períodos superiores a 6 h e 2 h de hidrólise, respectivamente. Ensaios de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor, a 50°C, com adição de 10 FPU.gms-1 de celulases produzidas por Myceliopthora sp. M77 em meio SB (10:90) resultaram conversão de celulose a glicose 50% maior do que para o ensaio de hidrólise nas mesmas condições com enzimas produzidas em meio TB (40:60), indicando que a composição dos extratos enzimáticos produzidos em meio TB e SB são diferentes. A concentração inicial de glicose de 1 g.L-1 no extrato produzido em meio TB pode ter inibido a ação da enzima b-glicosidade. Já os extratos produzidos em meio SB apresentaram concentrações de glicose inicial inferiores a 0,15 g.L-1. Ensaios de hidrólise com enzimas aderidas ao meio de cultura sólido foram realizados com a finalidade de avaliar essa metodologia em comparação à hidrólise usual com enzimas extraídas do meio. Após 48 h, as conversões de celulose a glicose das hidrólises de celulose cristalina ou bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão à vapor com enzimas aderidas ao meio de cultura foram ou superiores ou iguais àquelas obtidas nas hidrólises com enzimas extraídas do meio de cultura. Esse resultado mostra que existe a possibilidade de aplicação direta da enzima não extraída do meio de cultura sólido, com consequente redução do custo do processo de hidrólise do material celulósico para liberação de açúcares fermentescíveis. / The objectives of this study are: (1) to evaluate the production of cellulases by a thermophilic fungus, Myceliophthora sp. M77, isolated by the BIOTA-FAPESP program. The microorganism was cultivated in media composed by sugarcane bagasse (B) and wheat bran (T) or soybean meal (S), thus, solid state cultivation; (2) to evaluate the effectiveness of these enzymes in the hydrolysis of sugarcane bagasse and crystalline cellulose. The highest cellulases concentration in Erlenmeyer flasks cultures was achieved in medium SB (10:90) (w/w) with initial moisture of 80%, 10.3 FPU.gdm-1 after five days of cultivation, a value 120% higher than 4.8 U.gdm-1, which was the highest recorded cellulases concentration in culture using TB (20:80) with 60% of initial moisture. Applying forced aeration in the cultivation of Myceliophthora sp. M77 in medium SB (10:90) with 80% initial moisture, in fixed bed reactor, cellulases concentration and maximum productivity raised 30% relative to cultivation in Erlenmeyer flask. Hydrolysis assays at temperatures of 50°C, 60°C and 70°C were performed to evaluate the optimal temperature for application of cellulases produced by the fungus Myceliophthora sp. M77, since it is a thermophilic fungus. It was used the enzymatic extract produced from cultures in medium SB (10:90) with 60% initial moisture, at 50°C, for three days. After 48 h of hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion, the conversion of cellulose to glucose was 15% for T = 50 ° C, 8% for T = 60 ° C and 1.5% T = 70 ° C. These results indicated that thermal denaturation may occur in hydrolysis at 60°C and 70°C for periods longer of 6 h and 2 h, respectively. Hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion at 50°C with addition of 10 FPU.gdm-1 of cellulases produced by Myceliopthora sp. M77 in medium TB (40:60), resulted in conversion of cellulose to glucose 50% lower than hydrolysis with enzymes produced in medium SB (10:90), under the same conditions, indicating that the composition of enzyme extracts produced in TB and SB medium are different. The initial glucose concentration of 1 g.L-1 in the enzyme extract produced in TB medium can inhibit the action of the enzyme b-glucosidade. On the other hand, initial glucose concentration in the extract produced in medium SB was lower than 0.15 g.L-1. Hydrolysis using enzymes adhered to the solid culture medium were performed in order to compare this method to the usual hydrolysis with enzymes extracted from the medium. After 48 h, the cellulose conversion to glucose in the hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion or crystalline cellulose were either greater than or equal to those obtained by hydrolysis with enzymes extracted from the culture medium. This result shows that there is the possibility of direct application of the enzyme still adhered to the solid culture medium, with consequent reduction of the process cost of cellulosic materials hydrolysis to release fermentable sugars.

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No. of bitstreams: 1 DissHCRF.pdf: 2021523 bytes, checksum: 49238f07e8f2a02f9b4b2fad743ff733 (MD5) Previous issue date: 2016-03-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Solid-state cultivation (SSC) are characterized by microbial growth on solid supports, often agroindustrial by-products, in conditions of absence of free water. Citric acid and ethanol are important commercial bioproducts used in various industrial sectors, which could be obtained by SSC of fungi from bagasse sugarcane and vinasse, with subsequent fermentation, minimizing the cost of production with the use two industrial byproducts. Fungi consortium has advantages over the isolated cultures, highlighting the best use of substrates due to enzyme supplementation, especially in terms of hydrolases. In this sense, the aim of this research was to evaluate the SSC of Aspergillus niger and Trichoderma reesei alone for the production of citric acid from sugarcane bagasse impregnated with different solutions (sucrose and vinasse) and the consortium of these fungi followed by ethanol fermentation of fungal yeast extract. The experimental steps set up the cultivation of A. niger for production of citric acid from submerged particles of sugarcane bagasse; SSC of A. niger and T. reesei alone and mixed using as impregnating with and without sucrose solution and vinasse pretreated with acid hydrolysis; ethanol fermentation of fungal extract by Saccharomyces cerevisiae. Results indicate the feasibility of Aspergillus niger´growth on submerged particles of sugarcane bagasse for citric acid production in medium with addition of sucrose. SSC of this fungus from sugarcane bagasse resulted in 103 mg L-1 of citric acid content in 4 days without addition of sucrose to the solid medium. Similarly, SSC of Trichoderma reesei in sugarcane bagasse leads citric acid production around 67 mg L-1 with raw vinasse in the first growth day. Specific production of 2.51 mg g-1 h-1 in terms of citric acid was obtained from the fungal consortium higher than that obtained using the two fungi alone. Ethanol fermentation tests by Saccharomyces cerevisiae from the fungal extract obtained by the SSC indicated that it is feasible to obtain a second bioproduct, especially high yield of glucose into ethanol to extract condition obtained from T. reesei without sucrose in 5 days. Results suggests the viability in the use of two important by-products of the sugarcane industry via microbial consortium by SSC, leading an interesting research field with various scientific and regional aspects. / O cultivo em estado sólido (CES) caracteriza-se pelo crescimento microbiano em suportes sólidos, muitas vezes subprodutos agroindustriais, em condições próximas da ausência de água livre. Ácido cítrico e etanol são importantes bioprodutos comerciais utilizados em vários setores industriais, os quais poderiam ser obtidos agregando o CES de fungos a partir de bagaço de cana-de-açúcar e vinhaça, com posterior fermentação, minimizando o custo de sua produção com o aproveitamento de dois subprodutos industriais. O consórcio de fungos apresenta vantagens sobre as culturas isoladas, destacando-se no melhor aproveitamento dos substratos devido à complementação enzimática, principalmente em termos de hidrolases. Nesse sentido, o objetivo do trabalho foi avaliar o CES de Aspergillus niger e Trichoderma reesei isoladamente para a produção de ácido cítrico a partir de bagaço de cana-de-açúcar impregnado com soluções distintas (sacarose e vinhaça), assim como o consórcio destes fungos, seguido de fermentação etanólica do extrato fúngico por leveduras. As etapas experimentais desta dissertação compreendem o cultivo de A. niger para produção de ácido cítrico a partir de partículas de bagaço de cana-de-açúcar submersas; CES de A. niger e T. reesei isoladamente e consorciados utilizando como soluções impregnantes água deionizada com e sem sacarose e vinhaça bruta e pré-tratada com hidrólise ácida; fermentação etanólica do extrato fúngico por Saccharomyces cerevisiae. Os resultados indicam a viabilidade do cultivo de Aspergillus niger em partículas de bagaço de canade- açúcar submersas com produção de ácido cítrico em meio com adição de sacarose. O CES deste fungo a partir de bagaço de cana-de-açúcar levou a uma produção máxima de 103 mg L-1 de ácido cítrico em 4 dias sem adição de sacarose ao meio sólido. Da mesma forma, Trichoderma reesei apresentou crescimento em bagaço de cana-deaçúcar, com destaque para a produção de ácido cítrico em torno de 67 mg L-1 com vinhaça bruta em 1 dia. A produção específica de 2,51 mg g-1h-1 em termos de ácido cítrico foi obtida com o consórcio fúngico, superior ao obtido empregando os dois fungos isoladamente. Os ensaios de fermentação etanólica por Saccharomyces cerevisiae a partir do extrato fúngico obtido pelo CES indicaram que é viável a obtenção de um segundo bioproduto, com destaque para o elevado rendimento de glicose em etanol para a condição de extrato obtido a partir de T. reesei sem sacarose em 5 dias. Os resultados da pesquisa indicaram a viabilidade no aproveitamento de dois subprodutos importantes do setor sucroenergético via consórcios microbianos por CES, possibilitando um campo de pesquisas interessante devido aos seus diversos aspectos científicos e regionais.

São objetivos deste trabalho: (1) avaliar a produção de celulases pelo fungo termofílico Myceliophthora sp. M77, isolado no âmbito do programa BIOTA-FAPESP, cultivando-o em meios compostos por bagaço de cana-de-açúcar (B) e farelo de trigo (T) ou farelo de soja (S), portanto, cultivos em estado sólido; (2) avaliar a eficácia das enzimas na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar e celulose cristalina. Nos cultivos em frascos Erlenmeyer, o maior valor de concentração de celulases foi obtido em meio SB (10:90) (porcentagem em massa) com 80% de umidade inicial, 10,3 FPU.gms-1 após cinco dias de cultivo, valor este 120% superior ao valor de 4,8 U.gms-1, que foi a maior concentração de celulases registrada no cultivo em meio TB (20:80) com 60% de umidade inicial. O uso de aeração forçada no cultivo de Myceliophthora sp. M77 em meio SB (10:90) com 80% de umidade inicial, em reator de leito fixo, resultou aumento de 30% na concentração de celulase e na máxima produtividade em relação aos cultivos em frasco Erlenmeyer. Ensaios de hidrólise nas temperaturas de 50°C, 60°C e 70°C foram realizados para determinação da melhor temperatura de ação das celulases produzidas pelo fungo Myceliophthora sp. M77. Utilizou-se extrato obtido a partir do cultivo de Myceliophthora sp. M77 em meio SB (10:90) com umidade inicial de 60% a 45°C por 3 dias. Após 48h de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor, a conversão de celulose a glicose foi de 15% para T=50°C, 8% para T=60°C e 1,5% para T=70°C. Os resultados indicam que pode ocorrer desnaturação térmica a 60°C e 70°C para períodos superiores a 6 h e 2 h de hidrólise, respectivamente. Ensaios de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor, a 50°C, com adição de 10 FPU.gms-1 de celulases produzidas por Myceliopthora sp. M77 em meio SB (10:90) resultaram conversão de celulose a glicose 50% maior do que para o ensaio de hidrólise nas mesmas condições com enzimas produzidas em meio TB (40:60), indicando que a composição dos extratos enzimáticos produzidos em meio TB e SB são diferentes. A concentração inicial de glicose de 1 g.L-1 no extrato produzido em meio TB pode ter inibido a ação da enzima b-glicosidade. Já os extratos produzidos em meio SB apresentaram concentrações de glicose inicial inferiores a 0,15 g.L-1. Ensaios de hidrólise com enzimas aderidas ao meio de cultura sólido foram realizados com a finalidade de avaliar essa metodologia em comparação à hidrólise usual com enzimas extraídas do meio. Após 48 h, as conversões de celulose a glicose das hidrólises de celulose cristalina ou bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão à vapor com enzimas aderidas ao meio de cultura foram ou superiores ou iguais àquelas obtidas nas hidrólises com enzimas extraídas do meio de cultura. Esse resultado mostra que existe a possibilidade de aplicação direta da enzima não extraída do meio de cultura sólido, com consequente redução do custo do processo de hidrólise do material celulósico para liberação de açúcares fermentescíveis. / The objectives of this study are: (1) to evaluate the production of cellulases by a thermophilic fungus, Myceliophthora sp. M77, isolated by the BIOTA-FAPESP program. The microorganism was cultivated in media composed by sugarcane bagasse (B) and wheat bran (T) or soybean meal (S), thus, solid state cultivation; (2) to evaluate the effectiveness of these enzymes in the hydrolysis of sugarcane bagasse and crystalline cellulose. The highest cellulases concentration in Erlenmeyer flasks cultures was achieved in medium SB (10:90) (w/w) with initial moisture of 80%, 10.3 FPU.gdm-1 after five days of cultivation, a value 120% higher than 4.8 U.gdm-1, which was the highest recorded cellulases concentration in culture using TB (20:80) with 60% of initial moisture. Applying forced aeration in the cultivation of Myceliophthora sp. M77 in medium SB (10:90) with 80% initial moisture, in fixed bed reactor, cellulases concentration and maximum productivity raised 30% relative to cultivation in Erlenmeyer flask. Hydrolysis assays at temperatures of 50°C, 60°C and 70°C were performed to evaluate the optimal temperature for application of cellulases produced by the fungus Myceliophthora sp. M77, since it is a thermophilic fungus. It was used the enzymatic extract produced from cultures in medium SB (10:90) with 60% initial moisture, at 50°C, for three days. After 48 h of hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion, the conversion of cellulose to glucose was 15% for T = 50 ° C, 8% for T = 60 ° C and 1.5% T = 70 ° C. These results indicated that thermal denaturation may occur in hydrolysis at 60°C and 70°C for periods longer of 6 h and 2 h, respectively. Hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion at 50°C with addition of 10 FPU.gdm-1 of cellulases produced by Myceliopthora sp. M77 in medium TB (40:60), resulted in conversion of cellulose to glucose 50% lower than hydrolysis with enzymes produced in medium SB (10:90), under the same conditions, indicating that the composition of enzyme extracts produced in TB and SB medium are different. The initial glucose concentration of 1 g.L-1 in the enzyme extract produced in TB medium can inhibit the action of the enzyme b-glucosidade. On the other hand, initial glucose concentration in the extract produced in medium SB was lower than 0.15 g.L-1. Hydrolysis using enzymes adhered to the solid culture medium were performed in order to compare this method to the usual hydrolysis with enzymes extracted from the medium. After 48 h, the cellulose conversion to glucose in the hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion or crystalline cellulose were either greater than or equal to those obtained by hydrolysis with enzymes extracted from the culture medium. This result shows that there is the possibility of direct application of the enzyme still adhered to the solid culture medium, with consequent reduction of the process cost of cellulosic materials hydrolysis to release fermentable sugars.