Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A produção e a otimização de substâncias de valor medicinal têm sido alcançadas pelo uso das técnicas de cultura de tecidos vegetais, que têm apresentado grande relevância quando se considera o status de conservação de uma espécie ou sua ocorrência em ambientes ameaçados. No presente trabalho foi avaliada a produção de carotenoides em culturas de calos e células em suspensão de Cleome rosea Vahl ex DC, espécie nativa encontrada em áreas de restinga nos estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. Plantas micropropagadas obtidas a partir de raízes produzidas in vitro foram usadas como fonte de explantes para o início das culturas de calos. A produção de massa calogênica foi avaliada em meio MS suplementado com diferentes concentrações das auxinas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolínico, na presença de luz ou no escuro. O uso de diferentes meios básicos de cultura (B5, Nitsch, White) também foi avaliado. A calogênese foi induzida em todos os tratamentos, entretanto a maior produção de biomassa foi alcançada pelas culturas mantidas na presença de luz. A maior produção de massa calogênica foi obtida em culturas iniciadas no meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D. A exposição das culturas à luz foi um fator essencial para a produção de carotenoides, que só ocorreu nas culturas mantidas nessa condição. Culturas de calos foram submetidas a tratamentos com substâncias elicitoras (extrato de levedura, metil jasmonato, quitosana) em diferentes concentrações e por um período de exposição de sete ou 14 dias visando otimizar a produção do pigmento. A maior produção de carotenoides nas culturas elicitadas foi alcançada com o tratamento com metil jasmonato (MJ) na concentração de 300 μM, independentemente do tempo de exposição ao elicitor. Análises cromatográficas mostraram que o processo de elicitação com MJ induziu ao aumento na produção de β-caroteno. Calos elicitados nessa condição foram usados para iniciar culturas de células em suspensão (CCS). Estas culturas foram acompanhadas por três subculturas realizadas a cada 20 dias, durante a fase exponencial de crescimento. Embora as CCS tenham mantido uma produção de biomassa constante ao longo das subculturas, os valores de produção de carotenoides foram inferiores àqueles alcançados pelas culturas de calos e não houve diferenças estatísticas significativas quando comparadas às CCS iniciadas a partir de calos não elicitados. Extratos de calos produzidos em meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D foram avaliados quanto à sua capacidade antioxidante por meio da incubação dos extratos com DNA plasmidial em presença de cloreto estanoso (SnCl2), um potente agente redutor capaz de produzir quebras na molécula de DNA. Os extratos foram avaliados em concentrações crescentes (25 - 500 μg.mL-1) e apresentaram uma proteção dose dependente à ação do SnCl2. Estudos de toxicidade com o modelo de Artemia salina demonstraram que os extratos não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os resultados alcançados mostram que a elicitação foi eficiente para a otimização da produção de β-caroteno nas culturas in vitro e que os extratos obtidos a partir desses materiais apresentaram atividade antioxidante, indicando o êxito das técnicas de cultura de tecidos para a produção deste metabólito sob condição in vitro. / The production and optimization of plants secondary metabolites with medicinal value have been achieved by using plant tissue culture techniques, which have showed great relevance when considering the conservation status of a species or their occurrence in degraded environments. The present study assessed the production of carotenoids in callus and cell suspension cultures of Cleome rosea Vahl ex DC (Capparaceae), a Brazilian native herbaceous species that occurs mainly in coastal sandy plains (restingas) in the states of Rio de Janeiro and São Paulo. Micropropagated plants obtained from in vitro roots were used as source of explants for callus cultures. Callus biomass accumulation was evaluated on MS medium supplemented with different concentrations of the auxins 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (PIC), in the presence of light and in the dark. The use of different culture basal media (B5, Nitsch, and White) was also evaluated. Calogenesis was induced in all treatments; however greater efficiency was achieved by cultures maintained in the light. Exposure of cultures to light was also an essential factor to induce the production of carotenoids. The highest biomass accumulation was achieved by cultures established on MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D. Callus cultures were subject to treatments with a range of elicitors (chitosan, methyl jasmonate, yeast extract), at different concentrations and time of exposure (7 or 14 days). The highest production of carotenoids was achieved by cultures treated with 300 μM methyl jasmonate (MJ), regardless of time exposure. The chromatographic analysis showed that elicitation with MJ induced an increase in the production of β-carotene. Elicited calluses were used to establish cell suspension cultures (CSC). These cultures were evaluated during three subsequent subcultures performed at 20 days each during the exponential growth phase. Although the CSC have maintained a steady biomass accumulation along successive subcultures, carotenoids content were lower than those achieved by callus cultures and did not present significant differences when compared to CSC established from no elicited callus. Extracts of callus obtained from MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D were evaluated for their antioxidant potential. These extracts were incubated with plasmid DNA in the presence of stannous chloride (SnCl2), a potent reduced agent. Extracts were used at increasing concentrations (25 - 500 μg.mL-1) and showed a dose-dependent protective action, regardless of their origin. Studies of toxicity using the brine shrimp lethality bioassay revealed that the extracts were not toxic at tested concentrations. This study showed that the use of elicitation was a powerful tool in the optimization of β-carotene production in in vitro cultures of C. rosea and that extracts obtained from these cultures have antioxidant activity, indicating the success of plant tissue culture techniques for production of this metabolite under in vitro condition.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A produção e a otimização de substâncias de valor medicinal têm sido alcançadas pelo uso das técnicas de cultura de tecidos vegetais, que têm apresentado grande relevância quando se considera o status de conservação de uma espécie ou sua ocorrência em ambientes ameaçados. No presente trabalho foi avaliada a produção de carotenoides em culturas de calos e células em suspensão de Cleome rosea Vahl ex DC, espécie nativa encontrada em áreas de restinga nos estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. Plantas micropropagadas obtidas a partir de raízes produzidas in vitro foram usadas como fonte de explantes para o início das culturas de calos. A produção de massa calogênica foi avaliada em meio MS suplementado com diferentes concentrações das auxinas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolínico, na presença de luz ou no escuro. O uso de diferentes meios básicos de cultura (B5, Nitsch, White) também foi avaliado. A calogênese foi induzida em todos os tratamentos, entretanto a maior produção de biomassa foi alcançada pelas culturas mantidas na presença de luz. A maior produção de massa calogênica foi obtida em culturas iniciadas no meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D. A exposição das culturas à luz foi um fator essencial para a produção de carotenoides, que só ocorreu nas culturas mantidas nessa condição. Culturas de calos foram submetidas a tratamentos com substâncias elicitoras (extrato de levedura, metil jasmonato, quitosana) em diferentes concentrações e por um período de exposição de sete ou 14 dias visando otimizar a produção do pigmento. A maior produção de carotenoides nas culturas elicitadas foi alcançada com o tratamento com metil jasmonato (MJ) na concentração de 300 μM, independentemente do tempo de exposição ao elicitor. Análises cromatográficas mostraram que o processo de elicitação com MJ induziu ao aumento na produção de β-caroteno. Calos elicitados nessa condição foram usados para iniciar culturas de células em suspensão (CCS). Estas culturas foram acompanhadas por três subculturas realizadas a cada 20 dias, durante a fase exponencial de crescimento. Embora as CCS tenham mantido uma produção de biomassa constante ao longo das subculturas, os valores de produção de carotenoides foram inferiores àqueles alcançados pelas culturas de calos e não houve diferenças estatísticas significativas quando comparadas às CCS iniciadas a partir de calos não elicitados. Extratos de calos produzidos em meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D foram avaliados quanto à sua capacidade antioxidante por meio da incubação dos extratos com DNA plasmidial em presença de cloreto estanoso (SnCl2), um potente agente redutor capaz de produzir quebras na molécula de DNA. Os extratos foram avaliados em concentrações crescentes (25 - 500 μg.mL-1) e apresentaram uma proteção dose dependente à ação do SnCl2. Estudos de toxicidade com o modelo de Artemia salina demonstraram que os extratos não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os resultados alcançados mostram que a elicitação foi eficiente para a otimização da produção de β-caroteno nas culturas in vitro e que os extratos obtidos a partir desses materiais apresentaram atividade antioxidante, indicando o êxito das técnicas de cultura de tecidos para a produção deste metabólito sob condição in vitro. / The production and optimization of plants secondary metabolites with medicinal value have been achieved by using plant tissue culture techniques, which have showed great relevance when considering the conservation status of a species or their occurrence in degraded environments. The present study assessed the production of carotenoids in callus and cell suspension cultures of Cleome rosea Vahl ex DC (Capparaceae), a Brazilian native herbaceous species that occurs mainly in coastal sandy plains (restingas) in the states of Rio de Janeiro and São Paulo. Micropropagated plants obtained from in vitro roots were used as source of explants for callus cultures. Callus biomass accumulation was evaluated on MS medium supplemented with different concentrations of the auxins 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (PIC), in the presence of light and in the dark. The use of different culture basal media (B5, Nitsch, and White) was also evaluated. Calogenesis was induced in all treatments; however greater efficiency was achieved by cultures maintained in the light. Exposure of cultures to light was also an essential factor to induce the production of carotenoids. The highest biomass accumulation was achieved by cultures established on MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D. Callus cultures were subject to treatments with a range of elicitors (chitosan, methyl jasmonate, yeast extract), at different concentrations and time of exposure (7 or 14 days). The highest production of carotenoids was achieved by cultures treated with 300 μM methyl jasmonate (MJ), regardless of time exposure. The chromatographic analysis showed that elicitation with MJ induced an increase in the production of β-carotene. Elicited calluses were used to establish cell suspension cultures (CSC). These cultures were evaluated during three subsequent subcultures performed at 20 days each during the exponential growth phase. Although the CSC have maintained a steady biomass accumulation along successive subcultures, carotenoids content were lower than those achieved by callus cultures and did not present significant differences when compared to CSC established from no elicited callus. Extracts of callus obtained from MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D were evaluated for their antioxidant potential. These extracts were incubated with plasmid DNA in the presence of stannous chloride (SnCl2), a potent reduced agent. Extracts were used at increasing concentrations (25 - 500 μg.mL-1) and showed a dose-dependent protective action, regardless of their origin. Studies of toxicity using the brine shrimp lethality bioassay revealed that the extracts were not toxic at tested concentrations. This study showed that the use of elicitation was a powerful tool in the optimization of β-carotene production in in vitro cultures of C. rosea and that extracts obtained from these cultures have antioxidant activity, indicating the success of plant tissue culture techniques for production of this metabolite under in vitro condition.