Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-04-01T18:31:54Z No. of bitstreams: 1 2016_KarinaOliveiradaCosta.pdf: 2735810 bytes, checksum: 2755a4d40bbd144db37c37b9740ac24e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-26T21:44:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_KarinaOliveiradaCosta.pdf: 2735810 bytes, checksum: 2755a4d40bbd144db37c37b9740ac24e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T21:44:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_KarinaOliveiradaCosta.pdf: 2735810 bytes, checksum: 2755a4d40bbd144db37c37b9740ac24e (MD5) / Variações no ambiente de crescimento de microrganismos podem ter impactos consideráveis sobre a quantidade e diversidade de metabólitos secundários produzidos por esses. Assim, a otimização de culturas microbianas, pode ter efeitos significativos quando se quer aumentar o rendimento de um determinado metabólito. Este trabalho foi realizado para avaliar a influência de alguns fatores nutricionais e ambientais sobre a produção de compostos fenólicos (flavonoides e polifenóis), assim como foi conduzida a otimização das condições experimentais que resultassem em uma atividade antioxidante mais elevada dos extratos dos metabólitos produzidos pelo fungo Phomopsis sp., isolado a partir de folhas da Bauhinia variegata. Para a otimização da produção de polifenóis totais, flavonoides e da atividade antioxidante dos extratos (variáveis dependentes – respostas preditas), foi realizado um delineamento experimental fatorial 23 no modelo de faces centradas (DFC), com três variáveis independentes denominadas pH inicial do meio, temperatura de incubação (°C) e concentração de peptona no meio (g/L). As variáveis independentes foram codificadas em três níveis (-1, 0, +1). Utilizando-se a ferramenta de planejamento experimental com a metodologia de superfície de resposta (MSR) foi possível investigar a influência das variáveis independentes, assim como a forma de interação entre elas. O comportamento da produção de flavonoides e polifenóis, assim como da atividade antioxidante quando em diferentes condições ambientais foi eficientemente compreendido através de métodos estatísticos. Modelos polinomiais de segunda ordem foram utilizados para prever cada uma das três respostas. A análise de regressão da resposta atividade antioxidante mostrou que 93,9% da variação foi explicada pelo modelo. Estes resultados indicam que fatores nutricionais e ambientais desempenham um papel importante na produção de metabólitos secundários com atividade antioxidante pelo fungo Phomopsis sp. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Variations in microbial growth environment can have significant impacts on the quantity and diversity of secondary metabolites produced. Thus, the optimization of microbial cultures may have significant effects when one wants to increase throughput of a particular metabolite. This study was conducted to evaluate the influence of nutrition and environmental factors on the production of phenolic compounds (polyphenols and flavonoids), as well as optimization of the experimental conditions that would result in a higher antioxidant activity on the extracts of the metabolites produced by the fungus Phomopsis sp. isolated from Bauhinia variegata leaves. For optimization of the production of total polyphenols, flavonoids as well as extracts with high antioxidant activity (dependent variables - predicted responses) a factorial experimental design 23 was performed using a face-centered cubic design (FCD) of experiments, with three independent variables, namely initial pH, incubation temperature (°C) and concentration of peptone (g/L). The independent variable were coded at three levels (-1, 0, +1). Using the experimental design tool with the response surface methodology (RSM) was possible to investigate the influence of the independent variables, as well as the form of interaction between them. Second order polynomial models were used to predict each of the three answers. The regression analysis of the antioxidant activity response showed that 93.9% of the variation was explained by the model. These results indicate that nutritional and environmental factors play an important role in production of secondary metabolites with antioxidant activity, which can be better understood and studied using mathematical and statistical methods. The production profile of flavonoids and polyphenols, as well as antioxidant activity of the extracts produced by Phomopsis sp. in different environmental conditions were efficiently predicted using statistical methods.

O estudo das interações planta-microrganismos tem sido de grande interesse ao longo dos últimos anos. Atualmente, as interações que ocorrem entre microrganismos que vivem em estreita relação também vêm merecendo grande atenção, pois forças competitivas e mutualísticas podem induzir a produção de novos metabólitos bioativos. Portanto, estudar interações existentes entre os microrganismos endofíticos que colonizam uma mesma planta parece ser uma estratégia promissora para a obtenção de substâncias quimicamente diferentes, eventualmente bioativas. Através da utilização de culturas mistas de microrganismos, o presente trabalho contribuiu para o conhecimento da relação existente entre os fungos endofíticos SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) e SS84 (Phoma betae), isolados da planta medicinal Smallanthus sonchifolius (yacon), e sua implicação no aumento da diversidade química de produtos naturais microbianos, com o intuito de se identificar metabólitos secundários anticancerígenos. Para isso, os fungos foram cultivados em culturas singles e mistas em meios de cultivo líquidos e semi-sólidos. Foram utilizados diferentes meios de cultura, diferentes maneiras de se estabelecer o cultivo misto e diferentes formas de extração. Os extratos foram analisados química e biologicamente. Após fracionamento, foram isoladas cinco substâncias: afidicolina (I), 3-desóxi-afidicolina (II), estenfiperilenol (III), alterperilenol (IV) e alternariol monometil éter (V), sendo as duas primeiras de origem terpênica e as outras de origem policetídica. As substâncias I e II foram produzidas pelo fungo SS67, sendo que a produção de I aparentemente aumentou nas culturas mistas líquidas com SS13 e SS84, diminuindo consideravelmente na cultura mista com SS77. Devido à afidicolina ser um composto altamente citotóxico, os cultivos do fungo SS67 originaram extratos muito ativos frente aos ensaios de citotoxicidade em células cancerígenas. A substância III, primeiramente, só foi detectada por CLAE-DAD na cultura mista dos fungos SS67 e SS77, e a produção da substância IV foi maior nessa cultura mista que na cultura simples do fungo SS77 (meio fermentativo de extrato de malte). Provavelmente esses compostos foram produzidos por SS77 em resposta à presença de SS67. O extrato obtido durante esse cultivo misto foi o que apresentou maior atividade citotóxica frente à linhagem celular MDAMB-435 (câncer de mama). Posteriormente, a substância III foi também isolada da cultura simples do fungo SS77 cultivado em outras condições (meio fermentativo PDB), juntamente com a substância V. Os experimentos de antagonismo em placa de Petri envolvendo esses dois fungos revelaram, ainda, a presença de vários outros compostos na zona de inibição, que não correspondem às substâncias previamente isoladas de meio líquido, e podem ser responsáveis pelo efeito antagônico observado em meio semi-sólido. Os experimentos de atividade antagônica dos metabólitos produzidos pelos fungos evidenciaram que muitos compostos ativos, provavelmente, são produzidos em quantidades ínfimas, o que impossibilita a detecção por CLAE-DAD. Além disso, verificou-se que a substância I não possui atividade antifúngica significativa contra os fungos SS13, SS50 e SS77 e que a inibição de SS67 por SS77 ocorre devido à produção de compostos difusíveis em meio semi-sólido, e ainda, muito provavelmente, pela produção da substância III e IV em meio líquido, além de outros policetídeos. A produção de metabólitos secundários por fungos endofíticos deve ocorrer em consequência do papel ecológico que desempenham na natureza. Assim, a utilização de culturas mistas desses microrganismos deve induzir a produção de compostos que não seriam produzidos em condições não naturais. / The study of plant-microbe interactions has been of great interest over the past years. Currently, the interactions that occur among organisms that live in close relationship also have been receiving great attention because mutualistic and competitive forces may induce the production of new bioactive metabolites. Therefore, studying the interactions between endophytic microorganisms that colonize the same plant seems to be a promising strategy for obtaining chemically different substances that might also be bioactive. Through the utilization of mixed microbial cultures, this study contributed to knowledge of the relationship among the endophytic fungi SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) and SS84 (Phoma betae), isolated from the medicinal plant Smallanthus sonchifolius (yacon), and its role in the increase of the chemical diversity of microbial natural products, in order to identify anticancer secondary metabolites. For this aim, the fungi were grown in single and mixed cultures, both in liquid and semi-solid media. Different media, different approaches to establish the mixed cultures and different extraction methods were used. The extracts were analyzed chemically and biologically. After the fractionation, five compounds were isolated: aphidicolin (I), 3-deoxy-aphidicolin (II), stemphyperylenol (III), alterperylenol (IV) and alternariol monomethyl ether (V). Compounds I and II are terpene derivatives, while III, IV and V are polyketide derivatives. The substances I and II were produced by the fungus SS67, and the production of I apparently increased in liquid mixed cultures with SS13 and SS84, decreasing considerably in mixed culture with SS77. Due to the high cytotoxic activity of aphidicolin (I), the cultures of the fungus SS67 originated extracts highly active in the cytotoxicity assays in cancer cells. Substance III was only detected by HPLC-DAD in the mixed culture between the fungi SS67 and SS77, and the production of compound IV was higher in this mixed culture when compared to the single culture of the fungus SS77 (malt extract medium). Probably these compounds were produced by SS77 in response to the presence of SS67. The extract obtained during this mixed culture showed the highest cytotoxic activity against the cell line MDAMB-435 (breast cancer). In a subsequent fermentation in PDB medium, compound III was also isolated from the single culture of the fungus SS77 grown, along with compound V. Additionally, antagonism experiments in Petri dishes with these two fungi revealed the presence of several other compounds in the inhibition zone, which does not correspond to the substances previously isolated from the liquid medium, and may be responsible for the antagonistic effect observed in semi-solid medium. The experiments of antagonistic activity of metabolites produced by fungi showed that many active compounds are probably produced in very small quantities, making it impossible to detect by HPLC-DAD. Moreover, it was found that aphidicolin (I) did not have significant antifungal activity against the fungi SS13, SS50 and SS77 and that the SS67 inhibition by SS77 is due to the production of diffusible compounds in semi-solid medium, and likely, due to the production of compound III and IV in liquid medium, and other polyketides. The production of secondary metabolites by endophytic fungi probably occurs as a result of the ecological role they play in nature. Thus, the use of mixed cultures of these microorganisms may induce the production of compounds that would not be produced under unnatural conditions.

O estudo das interações planta-microrganismos tem sido de grande interesse ao longo dos últimos anos. Atualmente, as interações que ocorrem entre microrganismos que vivem em estreita relação também vêm merecendo grande atenção, pois forças competitivas e mutualísticas podem induzir a produção de novos metabólitos bioativos. Portanto, estudar interações existentes entre os microrganismos endofíticos que colonizam uma mesma planta parece ser uma estratégia promissora para a obtenção de substâncias quimicamente diferentes, eventualmente bioativas. Através da utilização de culturas mistas de microrganismos, o presente trabalho contribuiu para o conhecimento da relação existente entre os fungos endofíticos SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) e SS84 (Phoma betae), isolados da planta medicinal Smallanthus sonchifolius (yacon), e sua implicação no aumento da diversidade química de produtos naturais microbianos, com o intuito de se identificar metabólitos secundários anticancerígenos. Para isso, os fungos foram cultivados em culturas singles e mistas em meios de cultivo líquidos e semi-sólidos. Foram utilizados diferentes meios de cultura, diferentes maneiras de se estabelecer o cultivo misto e diferentes formas de extração. Os extratos foram analisados química e biologicamente. Após fracionamento, foram isoladas cinco substâncias: afidicolina (I), 3-desóxi-afidicolina (II), estenfiperilenol (III), alterperilenol (IV) e alternariol monometil éter (V), sendo as duas primeiras de origem terpênica e as outras de origem policetídica. As substâncias I e II foram produzidas pelo fungo SS67, sendo que a produção de I aparentemente aumentou nas culturas mistas líquidas com SS13 e SS84, diminuindo consideravelmente na cultura mista com SS77. Devido à afidicolina ser um composto altamente citotóxico, os cultivos do fungo SS67 originaram extratos muito ativos frente aos ensaios de citotoxicidade em células cancerígenas. A substância III, primeiramente, só foi detectada por CLAE-DAD na cultura mista dos fungos SS67 e SS77, e a produção da substância IV foi maior nessa cultura mista que na cultura simples do fungo SS77 (meio fermentativo de extrato de malte). Provavelmente esses compostos foram produzidos por SS77 em resposta à presença de SS67. O extrato obtido durante esse cultivo misto foi o que apresentou maior atividade citotóxica frente à linhagem celular MDAMB-435 (câncer de mama). Posteriormente, a substância III foi também isolada da cultura simples do fungo SS77 cultivado em outras condições (meio fermentativo PDB), juntamente com a substância V. Os experimentos de antagonismo em placa de Petri envolvendo esses dois fungos revelaram, ainda, a presença de vários outros compostos na zona de inibição, que não correspondem às substâncias previamente isoladas de meio líquido, e podem ser responsáveis pelo efeito antagônico observado em meio semi-sólido. Os experimentos de atividade antagônica dos metabólitos produzidos pelos fungos evidenciaram que muitos compostos ativos, provavelmente, são produzidos em quantidades ínfimas, o que impossibilita a detecção por CLAE-DAD. Além disso, verificou-se que a substância I não possui atividade antifúngica significativa contra os fungos SS13, SS50 e SS77 e que a inibição de SS67 por SS77 ocorre devido à produção de compostos difusíveis em meio semi-sólido, e ainda, muito provavelmente, pela produção da substância III e IV em meio líquido, além de outros policetídeos. A produção de metabólitos secundários por fungos endofíticos deve ocorrer em consequência do papel ecológico que desempenham na natureza. Assim, a utilização de culturas mistas desses microrganismos deve induzir a produção de compostos que não seriam produzidos em condições não naturais. / The study of plant-microbe interactions has been of great interest over the past years. Currently, the interactions that occur among organisms that live in close relationship also have been receiving great attention because mutualistic and competitive forces may induce the production of new bioactive metabolites. Therefore, studying the interactions between endophytic microorganisms that colonize the same plant seems to be a promising strategy for obtaining chemically different substances that might also be bioactive. Through the utilization of mixed microbial cultures, this study contributed to knowledge of the relationship among the endophytic fungi SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) and SS84 (Phoma betae), isolated from the medicinal plant Smallanthus sonchifolius (yacon), and its role in the increase of the chemical diversity of microbial natural products, in order to identify anticancer secondary metabolites. For this aim, the fungi were grown in single and mixed cultures, both in liquid and semi-solid media. Different media, different approaches to establish the mixed cultures and different extraction methods were used. The extracts were analyzed chemically and biologically. After the fractionation, five compounds were isolated: aphidicolin (I), 3-deoxy-aphidicolin (II), stemphyperylenol (III), alterperylenol (IV) and alternariol monomethyl ether (V). Compounds I and II are terpene derivatives, while III, IV and V are polyketide derivatives. The substances I and II were produced by the fungus SS67, and the production of I apparently increased in liquid mixed cultures with SS13 and SS84, decreasing considerably in mixed culture with SS77. Due to the high cytotoxic activity of aphidicolin (I), the cultures of the fungus SS67 originated extracts highly active in the cytotoxicity assays in cancer cells. Substance III was only detected by HPLC-DAD in the mixed culture between the fungi SS67 and SS77, and the production of compound IV was higher in this mixed culture when compared to the single culture of the fungus SS77 (malt extract medium). Probably these compounds were produced by SS77 in response to the presence of SS67. The extract obtained during this mixed culture showed the highest cytotoxic activity against the cell line MDAMB-435 (breast cancer). In a subsequent fermentation in PDB medium, compound III was also isolated from the single culture of the fungus SS77 grown, along with compound V. Additionally, antagonism experiments in Petri dishes with these two fungi revealed the presence of several other compounds in the inhibition zone, which does not correspond to the substances previously isolated from the liquid medium, and may be responsible for the antagonistic effect observed in semi-solid medium. The experiments of antagonistic activity of metabolites produced by fungi showed that many active compounds are probably produced in very small quantities, making it impossible to detect by HPLC-DAD. Moreover, it was found that aphidicolin (I) did not have significant antifungal activity against the fungi SS13, SS50 and SS77 and that the SS67 inhibition by SS77 is due to the production of diffusible compounds in semi-solid medium, and likely, due to the production of compound III and IV in liquid medium, and other polyketides. The production of secondary metabolites by endophytic fungi probably occurs as a result of the ecological role they play in nature. Thus, the use of mixed cultures of these microorganisms may induce the production of compounds that would not be produced under unnatural conditions.