O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.

O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.

O objetivo deste trabalho foi estudar o processo pelo qual hormônios e fatores de crescimento controlam a proliferação celular em mamíferos. O modelo experimental utilizado foi linhagens de células estabelecidas em cultura. Os estudos centraram-se em dois tipos básicos de células: fibroblastos e células adrenais e o ataque experimental foi feito sob dois pontos de vista: bioquímico e genético. O ataque bioquímico envolveu desenvolver estudos cinéticos da síntese de DNA não só durante o carenciamento de células para soro, como também durante a reestimulação de células carenciadas por:soro, hormônios e fatores de crescimento. Medidas do conteúdo intracelular de cAMP foram efetuadas com o intuito de adquirir informações à respeito do mecanismo de ação destes fatores. Um modelo de ciclo celular foi proposto no qual o controle do crescimento seria exercido através de reguladores positivos e negativos que agiriam estimulando ou inibindo a passagem de células do estado de repouso (Go) para a fase proliferativa. Entre os reguladores positivos (estimuladores) do sistema fibroblasto, encontra-se hormônios clássicos, como esteróides e insulina, e fatores de crescimento de natureza hormonal como EGF, PF (fator proteico extraído de glândulas pituitárias) e prostaglandina F2α. O esteróide hidrocortisona pode agir como regulador negativo, inibindo o crescimento de fibroblastos. Medidas do período de tempo transcorrido desde a estimulação de células carenciadas (Go), até o aparecimento da onda de síntese de DNA (período definido operacionalmente como Gl) foram feitas. Em fibroblastos 3T3 este período foi de 12 a 13 horas tanto para células estimuladas com soro como com hormônios clássicos (hidrocortisona, insulina) ou fatores de crescimento (EGF, PF) ou ainda com combinações deles (EGF + PF + insulina; PF + hidrocortisona; PF + hidrocortisona + insulina). No sistema células adrenais, adrenocorticotropina (ACTH) foi o único hormônio clássico que apresentou atividade sobre o crescimento destas células e também o único efetuador negativo encontrado. Neste sistema PF mostrou-se como o único fator com atividade estimulatória sobre o crescimento. Gl aqui foi de 11 horas tanto para células estimuladas com soro como com PF. Além disso os hormônios clássicos hidrocortisona e insulina não apresentaram atividade estimulatória por si só ou em combinação com PF. A análise da ação de hidrocortisona no sistema fibroblasto e de ACTH no sistema células adrenais estimuladas, forneceu evidências de que após deixar Go, em direção a S, numa certa altura de Gl as células tornam-se irreversivelmente comprometidas com o processo replicativo. Este comprometimento parece ocorrer 5 horas antes de S, sendo referido como Glc. Em face destes resultados foi proposto que os reguladores agem estimulando ou inibindo a transição Go → Glc. Na tentativa de obter maior definição do sistema de controle do crescimento, aproveitamo-nos das vantagens oferecidas pelo modelo experimental usado, para a busca de mutantes do tipo regulatório. Esta busca resultou no isolamento das linhagens ST1 e AR-1, derivadas, respectivamente, de fibroblastos 3T3 e células adrenais Y-l. Entre os vários aspectos interessantes da linhagem ST1 destaca-se: a) o dramático efeito de hidrocortisona causando mudança nas características das células as quais passam de um fenótipo tipicamente transformado para normal. Este fenômeno foi observado tanto \"in vitro\" (através de medidas de parâmetros de crescimento) como \"in vivo\" (através de ensaios de tumorogenicidade); b) as alterações morfológicas de caráter antagônico provocadas, por um lado, pela adição de hidrocortisona (causando achatamento) e, por outro, pela retirada do soro ou adição de cAMP ao meio de cultura (arredondamento). Através do estudo da ação de inibidores, obteve-se evidências do envolvimento de microtúbulos nestas alterações morfológicas. A análise do conteúdo intracelular de cAMP indicou que este nucleotídeo não atua como mediador da ação de hidrocortisona. Sua ação parece ser devida à indução de alterações no sistema superfície celular - membrana -citoesqueleto. Ao contrário de outros variantes de células Y-l resistentes à ACTH, células AR-1 mostraram-se também resistentes a cAMP. A utilidade destas células nos estudos da postulada mediação deste nucleotídeo na ação de ACTH, é óbvia. / The aim of this work was to study the process by which hormones and growth factors control proliferation of mammalian cells. Cell lines established in culture were used as the experimental model. The studies were centered on two basic types of cells: fibroblasts and adrenal cells and the experimental approach was made from two viewpoints: biochemical and genetic. The biochemical approach involved kinetic studies of the DNA synthesis process not only during serum starvation but also during restimulation of serum starved cells by serum, hormones and growth factors. Intracellular cyclic AMP determinations were made in order to gain informations on the mechanism of action of these factors. A cell cycle model was proposed in which cell growth control would be exerted by positive and negative regulators that would act by stimulating or inhibiting the flow of cells from a resting state (Go) to the proliferative phase. Among the positive regulators (stimulators) found for the fibroblast system are: classical hormones, like steroids and insulin, and growth factors of homonal nature, like EGF, PF (protein factor extracted from pituitary glands) and prostaglandin F2α. The steroid hydrocortisone can also act as a negative regulator, inhibiting fibroblast growth. Measurements of the time interval between stimulation of serum starved (Go) cells and the onset of DNA synthesis (period that is operationally defined as Gl) were made. In 3T3 fibroblasts this period was 12 to 13 hours for cells stimulated not only by serum but also by classical hormones (hydrocortisone, insulin) or growth factors (EGF, PF) or even by combinations of these factors (EGF + PF + insulin; PF + hydrocortisone; PF + hydrocortisone + insulin). In the adrenal system, adrenocorticotropin (ACTH) was the only classical hormone to present activity on the growth of these cells and also the only negative regulator found. In this system PF was shown to be the only factor with growth stimulatory activity. GL was estimated as 11 hours for cells stimulated with serum or PF. Moreover hydrocortisone and insulin had no stimulatory activity \"per si\" or in combination with PF. The analysis of hydrocortisone action on the fibroblast system on one hand and of that of ACTH on the adrenal system, on the other, indicated that upon leaving Go, towards S, at a certain point in Gl, cells become irreversibly committed to the replicative process. This commitment seems to occur 5 hours before S and is referred to as Glc. In view of these data we proposed that regulators act by stimulating or inhibiting the transition Go → Glc. In an attempt to obtain a better definition of the growth control system and taking advantage of the experimental model utilized, we searched for mutants of the regulatory type. This search resulted in the isolation of the lines ST1 and AR-l from 3T3 fibroblasts and Y-l adrenal cells, respectively. Among several interesting aspects of the STl cell line, we point out: a) the dramatic effect of hydrocortisone changing the characteristics of these cells from a typically transformed phenotype to a normal pattern. This phenomenon was observed both \"in vitro\" (by measuring a number of growth parameters) and \"in vivo\" (by tumorogenicity assays). b) morphological alterations of antagonistic nature caused by hydrocortisone (flattening) on one hand, and by the removal of serum or cAMP addition to the culture medium (rounding) on the other. Evidence for the involvement of microtubules in these alterations were obtained through studies on the action of several inhibitors. Quantitative analysis of intracellular cAMP indicated that this nucleotide does not act as a mediator of hydrocortisone action. Rather, this action seems to be due to the induction of alterations on the cell surface-membrane-cytoskeleton system. Contrary to other variants of the Y-1 line which are resistant to ACTH, AR-1 cells are also resistant to cAMP. The usefulness of these cells in studies of the postulated mediation by cAMP of the ACTH action, is obvious.

O objetivo deste trabalho foi estudar o processo pelo qual hormônios e fatores de crescimento controlam a proliferação celular em mamíferos. O modelo experimental utilizado foi linhagens de células estabelecidas em cultura. Os estudos centraram-se em dois tipos básicos de células: fibroblastos e células adrenais e o ataque experimental foi feito sob dois pontos de vista: bioquímico e genético. O ataque bioquímico envolveu desenvolver estudos cinéticos da síntese de DNA não só durante o carenciamento de células para soro, como também durante a reestimulação de células carenciadas por:soro, hormônios e fatores de crescimento. Medidas do conteúdo intracelular de cAMP foram efetuadas com o intuito de adquirir informações à respeito do mecanismo de ação destes fatores. Um modelo de ciclo celular foi proposto no qual o controle do crescimento seria exercido através de reguladores positivos e negativos que agiriam estimulando ou inibindo a passagem de células do estado de repouso (Go) para a fase proliferativa. Entre os reguladores positivos (estimuladores) do sistema fibroblasto, encontra-se hormônios clássicos, como esteróides e insulina, e fatores de crescimento de natureza hormonal como EGF, PF (fator proteico extraído de glândulas pituitárias) e prostaglandina F2α. O esteróide hidrocortisona pode agir como regulador negativo, inibindo o crescimento de fibroblastos. Medidas do período de tempo transcorrido desde a estimulação de células carenciadas (Go), até o aparecimento da onda de síntese de DNA (período definido operacionalmente como Gl) foram feitas. Em fibroblastos 3T3 este período foi de 12 a 13 horas tanto para células estimuladas com soro como com hormônios clássicos (hidrocortisona, insulina) ou fatores de crescimento (EGF, PF) ou ainda com combinações deles (EGF + PF + insulina; PF + hidrocortisona; PF + hidrocortisona + insulina). No sistema células adrenais, adrenocorticotropina (ACTH) foi o único hormônio clássico que apresentou atividade sobre o crescimento destas células e também o único efetuador negativo encontrado. Neste sistema PF mostrou-se como o único fator com atividade estimulatória sobre o crescimento. Gl aqui foi de 11 horas tanto para células estimuladas com soro como com PF. Além disso os hormônios clássicos hidrocortisona e insulina não apresentaram atividade estimulatória por si só ou em combinação com PF. A análise da ação de hidrocortisona no sistema fibroblasto e de ACTH no sistema células adrenais estimuladas, forneceu evidências de que após deixar Go, em direção a S, numa certa altura de Gl as células tornam-se irreversivelmente comprometidas com o processo replicativo. Este comprometimento parece ocorrer 5 horas antes de S, sendo referido como Glc. Em face destes resultados foi proposto que os reguladores agem estimulando ou inibindo a transição Go → Glc. Na tentativa de obter maior definição do sistema de controle do crescimento, aproveitamo-nos das vantagens oferecidas pelo modelo experimental usado, para a busca de mutantes do tipo regulatório. Esta busca resultou no isolamento das linhagens ST1 e AR-1, derivadas, respectivamente, de fibroblastos 3T3 e células adrenais Y-l. Entre os vários aspectos interessantes da linhagem ST1 destaca-se: a) o dramático efeito de hidrocortisona causando mudança nas características das células as quais passam de um fenótipo tipicamente transformado para normal. Este fenômeno foi observado tanto \"in vitro\" (através de medidas de parâmetros de crescimento) como \"in vivo\" (através de ensaios de tumorogenicidade); b) as alterações morfológicas de caráter antagônico provocadas, por um lado, pela adição de hidrocortisona (causando achatamento) e, por outro, pela retirada do soro ou adição de cAMP ao meio de cultura (arredondamento). Através do estudo da ação de inibidores, obteve-se evidências do envolvimento de microtúbulos nestas alterações morfológicas. A análise do conteúdo intracelular de cAMP indicou que este nucleotídeo não atua como mediador da ação de hidrocortisona. Sua ação parece ser devida à indução de alterações no sistema superfície celular - membrana -citoesqueleto. Ao contrário de outros variantes de células Y-l resistentes à ACTH, células AR-1 mostraram-se também resistentes a cAMP. A utilidade destas células nos estudos da postulada mediação deste nucleotídeo na ação de ACTH, é óbvia. / The aim of this work was to study the process by which hormones and growth factors control proliferation of mammalian cells. Cell lines established in culture were used as the experimental model. The studies were centered on two basic types of cells: fibroblasts and adrenal cells and the experimental approach was made from two viewpoints: biochemical and genetic. The biochemical approach involved kinetic studies of the DNA synthesis process not only during serum starvation but also during restimulation of serum starved cells by serum, hormones and growth factors. Intracellular cyclic AMP determinations were made in order to gain informations on the mechanism of action of these factors. A cell cycle model was proposed in which cell growth control would be exerted by positive and negative regulators that would act by stimulating or inhibiting the flow of cells from a resting state (Go) to the proliferative phase. Among the positive regulators (stimulators) found for the fibroblast system are: classical hormones, like steroids and insulin, and growth factors of homonal nature, like EGF, PF (protein factor extracted from pituitary glands) and prostaglandin F2α. The steroid hydrocortisone can also act as a negative regulator, inhibiting fibroblast growth. Measurements of the time interval between stimulation of serum starved (Go) cells and the onset of DNA synthesis (period that is operationally defined as Gl) were made. In 3T3 fibroblasts this period was 12 to 13 hours for cells stimulated not only by serum but also by classical hormones (hydrocortisone, insulin) or growth factors (EGF, PF) or even by combinations of these factors (EGF + PF + insulin; PF + hydrocortisone; PF + hydrocortisone + insulin). In the adrenal system, adrenocorticotropin (ACTH) was the only classical hormone to present activity on the growth of these cells and also the only negative regulator found. In this system PF was shown to be the only factor with growth stimulatory activity. GL was estimated as 11 hours for cells stimulated with serum or PF. Moreover hydrocortisone and insulin had no stimulatory activity \"per si\" or in combination with PF. The analysis of hydrocortisone action on the fibroblast system on one hand and of that of ACTH on the adrenal system, on the other, indicated that upon leaving Go, towards S, at a certain point in Gl, cells become irreversibly committed to the replicative process. This commitment seems to occur 5 hours before S and is referred to as Glc. In view of these data we proposed that regulators act by stimulating or inhibiting the transition Go → Glc. In an attempt to obtain a better definition of the growth control system and taking advantage of the experimental model utilized, we searched for mutants of the regulatory type. This search resulted in the isolation of the lines ST1 and AR-l from 3T3 fibroblasts and Y-l adrenal cells, respectively. Among several interesting aspects of the STl cell line, we point out: a) the dramatic effect of hydrocortisone changing the characteristics of these cells from a typically transformed phenotype to a normal pattern. This phenomenon was observed both \"in vitro\" (by measuring a number of growth parameters) and \"in vivo\" (by tumorogenicity assays). b) morphological alterations of antagonistic nature caused by hydrocortisone (flattening) on one hand, and by the removal of serum or cAMP addition to the culture medium (rounding) on the other. Evidence for the involvement of microtubules in these alterations were obtained through studies on the action of several inhibitors. Quantitative analysis of intracellular cAMP indicated that this nucleotide does not act as a mediator of hydrocortisone action. Rather, this action seems to be due to the induction of alterations on the cell surface-membrane-cytoskeleton system. Contrary to other variants of the Y-1 line which are resistant to ACTH, AR-1 cells are also resistant to cAMP. The usefulness of these cells in studies of the postulated mediation by cAMP of the ACTH action, is obvious.