Tesis por compendio / [ES] La detección y diagnóstico de resistencias en Mycobacterium tuberculosis (MTB) supone un reto para el control de la tuberculosis (TB). La técnica diagnóstica implica el cultivo de muestras diagnósticas, pero este proceso es lento y retrasa los resultados hasta meses demorando la prescripción del tratamiento óptimo. El cultivo también se utiliza para enriquecer muestras diagnósticas con fines de investigación, como la secuenciación del genoma de MTB. Sin embargo, se desconoce si cultivar reduce la diversidad genética de la muestra diagnóstica, sesgando los resultados. Actualmente, las técnicas moleculares permiten evitar el cultivo en el diagnóstico, detectando resistencia a antibióticos más rápidamente, pero se limitan a identificar las mutaciones comunes asociadas a la resistencia a la rifampicina (RIF) e isoniazida (INH), los fármacos de primera línea. No obstante, la composición compleja de las muestras diagnósticas como el esputo sigue siendo un desafío para la secuenciación. Esta tesis presenta técnicas y estrategias de secuenciación para recuperar MTB a partir de esputos, centrándose en la diversidad genética en esputos y cultivos y explorando el potencial de la secuenciación para determinar resistencias. En el Capítulo 1 comparamos la diversidad genética entre pares de esputos y cultivos en dos entornos diferentes. Desarrollamos una técnica de secuenciación de esputos, realizando una secuenciación directa o enriquecida según la cantidad de MTB presente. Además, implementamos un flujo de análisis para descartar artefactos del procesamiento de muestras. Los resultados muestran una alta concordancia en la diversidad entre esputos y cultivos, cuestionando la hipótesis inicial del cuello de botella en el cultivo. En el Capítulo 2 exploramos las limitaciones del Gene Xpert MTB/RIF Ultra (XpertUltra) para identificar mutaciones de resistencia a RIF, examinando las mutaciones de resistencia más prevalentes en el sur de Mozambique. Utilizamos la secuenciación del genoma completo para identificar variantes de resistencia en cepas recolectadas en Manhiça, Mozambique. Detectamos dos cepas con mutaciones de resistencia a RIF no identificadas por el XpertUltra y una alta prevalencia de cepas resistentes a INH sin resistencia a RIF (no multirresistentes, MDR). Los resultados sugieren que el XpertUltra podría no detectar algunos casos de resistencia a RIF y/o INH, destacando la necesidad de incluir nuevas mutaciones en las pruebas moleculares. En el Capítulo 3 evaluamos el potencial de la secuenciación de amplicones para predecir la resistencia a antibióticos e identificar el linaje de las cepas. Diseñamos un panel de nueve genes asociados a la resistencia a siete antibióticos y dos regiones filogenéticas, poniendo a punto una PCR multiplex para amplificar todas las regiones en una sola reacción. A diferencia de otros paneles, los cebadores diseñados cubren los genes completos para detectar todas las mutaciones presentes. La secuenciación se realiza con MinION (Nanopore), una plataforma portátil con análisis en tiempo real. Comparamos las variantes obtenidas con las de Illumina para calibrar los parámetros del llamado de variantes y evitar falsos positivos. Los resultados muestran una alta correlación entre MinION e Illumina en la detección de resistencia e identificación de linajes, independientemente del tipo de muestra. Estos resultados, junto con el análisis en tiempo real de MinION, son prometedores para su implementación en atención primaria. En conclusión, esta tesis contribuye a los avances en la genómica de muestras diagnósticas. Por un lado, demostrando que el cultivo refleja la diversidad genética del esputo, y por otro, revelando el potencial de la secuenciación del genoma y de amplicones para predecir resistencia a antibióticos. Las técnicas y resultados que se presentan contribuirán a promover la secuenciación directa de esputo como técnica de diagnóstico rápida y precisa, pero también su uso para la investigación. / [CA] La detecció i diagnòstic de resistències en Mycobacterium tuberculosis (MTB) suposa un repte per al control de la tuberculosi (TB). La tècnica de referència ha estat el cultiu de mostres diagnòstiques, però aquest procés és lent, retardant els resultats durant setmanes o mesos i dificultant la prescripció d'un tractament òptim. El cultiu també s'ha utilitzat per enriquir mostres diagnòstiques amb finalitats de recerca, com la seqüenciació del genoma de MTB. No obstant això, encara es desconeix si el cultiu redueix la diversitat genètica de la mostra diagnòstica, cosa que podria generar un biaix en els resultats. Actualment, les tècniques moleculars han permès evitar el cultiu en el diagnòstic, detectant resistència a antibiòtics més ràpidament, però es limiten a identificar les mutacions comunes associades a resistència a la rifampicina (RIF) i isoniazida (INH), els fàrmacs de primera línia. Tanmateix, la composició complexa de les mostres diagnòstiques com l'esput segueix sent un repte per a la seqüenciació. Aquesta tesi presenta tècniques i estratègies de seqüenciació per recuperar MTB a partir d'esputs, centrant-se en la diversitat genètica en esputs i cultius i explorant el potencial de la seqüenciació per determinar resistències. Al Capítol 1 comparem la diversitat genètica entre parelles d'esputs i cultius en dos entorns diferents. Desenvolupem una tècnica de seqüenciació d'esputs, realitzant una seqüenciació directa o enriquida segons la quantitat de MTB present. A més, implementem un flux d'anàlisi per descartar artefactes del processament de mostres. Els resultats mostren una alta concordança en la diversitat entre esputs i cultius, qüestionant la hipòtesi inicial d'un coll de botella al cultiu. Al Capítol 2 explorem les limitacions de la prova molecular Gene Xpert MTB/RIF Ultra (XpertUltra) per identificar mutacions de resistència a RIF, examinant les mutacions de resistència més prevalents al sud de Moçambic. Utilitzem la seqüenciació del genoma complet per identificar variants de resistència a antibiòtics en soques recol·lectades a Manhiça, Moçambic. Detectem dues soques amb mutacions de resistència a rifampicina no identificades per l'XpertUltra i una alta prevalença de soques resistents a INH sense resistència a RIF (no multiressistents, MDR). Els resultats sugereixen que l'XpertUltra pot no detectar alguns casos de resistència a RIF i/o INH, destacant la necessitat d'incloure noves mutacions en proves moleculars. Al Capítol 3 avaluem el potencial de la seqüenciació d'amplicons per predir resistència a antibiòtics i identificar el llinatge de les soques. Dissenyem un panell de nou gens associats a resistència a set antibiòtics i dues regions filogenètiques, posant a punt una PCR multiplex per amplificar totes les regions en una sola reacció. A diferència d'altres panells, els encebadors dissenyats cobreixen els gens complets, per detectar totes les mutacions presents. La seqüenciació es realitza amb MinION (Nanopore), una plataforma portàtil amb anàlisi en temps real. Comparem les variants obtingudes amb les d'Illumina per calibrar paràmetres per cridar de variants i evitar falsos positius. Els resultats mostren una alta correlació entre MinION i Illumina en la detecció de resistència i identificació de llinatges, independentment del tipus de mostra. Aquests resultats, juntament amb l'anàlisi en temps real de MinION, són prometedors per a la seva implementació en atenció primària. En conclusió, aquesta tesi contribueix als avanços en la genòmica directa de mostra diagnòstica. D'una banda, demostrant que el cultiu reflecteix la diversitat genètica de l'esput i, d'altra banda, revelant el potencial de la seqüenciació del genoma i d'amplicons per predir resistència a antibiòtics. Els resultats obtinguts superen les limitacions de les proves moleculars actuals, i les tècniques presentades podrien promoure la seqüenciació directa d'esput com a eina de diagnòstic ràpida i precisa, així com per a la investigació. / [EN] Mycobacterium tuberculosis (MTB) detection and diagnosis of drug resistance(DR) have been a challenge for tuberculosis(TB) control. Culturing mycobacteria from diagnostic samples has been the most commonly used diagnostic technique. However, culturing depends on MTB's slow growth, delaying results and the prescription of optimal treatment for weeks to months. Culture is also essential for research purposes such as MTB genomics. However, it remains unclear whether it causes a bottleneck in the sample's original genetic diversity, potentially biasing results. Skipping the culturing step has been possible with the introduction of molecular techniques in surveillance systems. These reduce turnaround time and allow MTB and DR detection through a single assay. However, such tests are limited to detecting common mutations associated with rifampicin(RIF) and isoniazid(INH) resistance. Moreover, the complex composition of diagnostic samples, like sputum, continues to challenge sequencing workflows in research. In this thesis, we explore different sequencing approaches to recover and sequence MTB from sputum samples, focusing on overcoming the hypothesized culture bottleneck and evaluating the potential of sequencing for DR prediction. In Chapter 1, we compare genetic diversity within sputum-culture paired samples in two settings. We implement a culture-free sequencing (cfWGS) approach for sputum, using both direct and enriched sequencing, depending on the initial amount of MTB DNA. We also develop an analysis pipeline to filter artifactual variants from cfWGS approaches. To generalize results, three additional datasets are reanalyzed. The results show high concordance in genetic diversity between sputum-culture pairs, both in terms of presence and frequency of variants. These results contradict the initial culture bottleneck assumption, emphasizing the importance of tailored filtering steps depending on sample complexity. In Chapter 2, we explore the limitations of the Gene Xpert MTB/RIF Ultra (XpertUltra) for detecting non-common mutations and screen for prevalent DR mutations in southern Mozambique. We use WGS to identify DR variants in strains collected in Manhiça (Mozambique) during two time periods. Two strains were found to harbor RIF resistance mutations beyond XpertUltra's detection scope. We also detect a high prevalence of INH-resistant strains without RIF resistance (non-MDR TB). This suggests that XpertUltra, the primary diagnostic tool in the region, sometimes misclassifies RIF-resistant cases, highlighting the need for expanded drug and mutation coverage in molecular diagnostic tests. In Chapter 3, we assess the potential of targeted sequencing for DR prediction and lineage identification by designing a gene panel of 9 genes associated with resistance to 7 drugs and two phylogenetic regions. We develop a multiplex PCR to amplify all target regions in one reaction. Unlike other commercial panels, our primers cover entire genes allowing the identification of all mutations, not just those in hotspot regions. We employ the portable MinION (Nanopore) platform, which provides real-time analysis. A key aim is to calibrate parameters for MinION variant calling by comparing its results to Illumina sequencing, establishing a frequency cut-off to avoid false positives due to MinION's error rate. Our results show high concordance between MinION and Illumina in detecting DR and genotyping, regardless of the sample type. These findings present a significant advantage for future implementation in point-of-care systems. This thesis advances the field of cfWGS by confirming that culture mirrors sputum's genetic diversity and demonstrating the potential of whole genome and targeted sequencing to overcome the limitations of current molecular diagnostic tests in predicting DR. The techniques and findings presented could help promote cfWGS as a front-line approach for faster, more accurate diagnosis, and contribute to further research. / This work has been supported by the following: European Research Council (ERC): H2020-ERC-COG/0800; Ministerio Español de Ciencia e Innovación: PID2022-137607OB-I00; Fundació La Caixa: HR21-00415, International Science and Technology Center (ISTC): Project #G-2143 and National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH). This work was also supported by STOP TB partnership [STBP/TBREACH/GSA/W5-30: CA-3-D000920001], the TB Portals programme of the National Institutes of Health, the European Research Council [101001038-TB-RECONNECT: H2020-ERC-COG/0800 and 638553-TB-ACCELERATE], Generalitat Valenciana [AICO/2018/113], the Spanish Ministry of Science and Innovation [PID2019-104477RB-I00] and the Ministerio de Economía, Indústria y Competividad (SAF2016-77346-R) / Mariner Llicer, C. (2024). Culture-Free Sequencing of Mycobacterium Tuberculosis for Diagnosis and Genetic Diversity Identification [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/213332 / Compendio