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Cianobactérias desempenham importante papel ecológico em diversos ecossistemas terrestres e aquáticos. Contudo, tornam-se problema de saúde pública quando biossintetizam compostos secundários tóxicos, denominados cianotoxinas, as quais podem atuar sobre diversos organismos. Sistemas aquáticos impactados favorecem o desenvolvimento destes microrganismos, que podem tornar-se dominantes em função dos diversos mecanismos que lhes conferem vantagens adaptativas em relação aos demais grupos fitoplanctônicos. Muitas vezes, elas apresentam-se sob forma de florescimento, cuja toxicidade varia de acordo com espécies e cepas que o compõem. Apesar das cianobactérias Cylindrospermopsis raciborskii e Microcystis aeruginosa formarem florações, terem potencial tóxico, serem competitivas e estarem presentes em diversos reservatórios, é desconhecido o efeito da interação entre elas na produção de microcistina. Para esclarecer esta questão, nesta pesquisa, foi estudada a interação entre cepas de C. raciborskii e M. aeruginosa visando: caracterizar o cultivo das espécies em monocultura e cultura mista; verificar se o caráter tóxico das cepas favoreceu a competição; mensurar a microcistina de M. aeruginosa e avaliar o efeito da interação sobre esta variável. Em salas climatizadas de cultivo (22ºC, fotoperíodo 12h, 60 \'mü\'mol photon/\'M POT.2\'.s) experimentos de interação foram realizados em culturas batch compostas por três tratamentos: (1) monocultura de M. aeruginosa, (2) monocultura de C. raciborskii, (3) cultura mista de M. aeruginosa e C. raciborskii. Foram realizadas análises da densidade e biovolume dos organismos, da velocidade específica de crescimento (\'mü\') e tempo de duplicação (Td) e da concentração de microcistinas, clorofila-a e nutrientes. A interação reduziu em até 22% a \'mü\' das linhagens estudadas. Tanto C. raciborskii quanto M. aeruginosa apresentaram vantagem competitiva em pelo menos um dos ensaios e, no caso de linhagem tóxica de M. aeruginosa, verificou-se que o seu caráter tóxico favoreceu a competição da espécie com linhagem atóxica de C. raciborskii. Além disso, M. aeruginosa elevou em até 53% a síntese de microcistina ao interagir com C. raciborskii. Este processo poderia se relacionar a três principais mecanismos: competição por interferência, produção de alelopáticos e comunicação química. Estudos de balanços genéticos dos florescimentos bem como da possível comunicação química existente entre cianobactérias são ferramentas investigativas importantes que poderão ajudar no aprimoramento da prevenção e manejo de florações tóxicas. / Cyanobacteria play important ecological role in many terrestrial and aquatic ecosystems. However, they become a public health problem when synthesize secondary toxic compounds, known as cyanotoxins, which may act on several organisms. Impacted aquatic systems favor their growth and these microorganisms can become dominant due to mechanisms that confer them adaptive advantages in relation to other phytoplanktonic groups. Frequently, cyanobacteria can form water blooms, whose toxicity varies according to their species and strains composition. Although the cyanobacteria Cylindrospermopsis raciborskii and Microcystis aeruginosa can form blooms, have toxic potential, are competitive and present in several reservoirs, it is unknown the interaction effect between them in the production of microcystins. To solve this question, the interaction among strains of C. raciborskii and M. aeruginosa was studied to: characterize the culture of the species in monoculture and mixed culture; check whether the character of toxic strains favored the competition; measure microcystin concentration produced by M. aeruginosa and evaluate interaction effect on this variable. In climatized growth room (22°C, 12h photoperiod, 60 \'mü\'mol photon/\'M POT.2\'.s) four interaction experiments composed by three treatments were performed in batch cultures: (1) monoculture of M. aeruginosa, (2) monoculture of C. raciborskii, (3) mixed culture of M. aeruginosa and C. raciborskii. Density and biovolume, specific growth rate (\'mü\'), doubling time (Td) and concentration of microcystin, chlorophyll-a and nutrients analyses were performed. The interaction reduced up to 22% the of studied strains. Both C. raciborskii and M. aeruginosa presented competitive advantage in at least one of the tests. In the case of toxic strain of M. aeruginosa, it was found that its toxic character favored the competition with non-toxic strain of C. raciborskii. Furthermore, M. aeruginosa increased by 53% the synthesis of microcystin while interacting with C. raciborskii. This process could be related to three main mechanisms: interference competition, communication and production of allelopathic chemicals. Genetical balance studies of blooms as the possible chemical communication existing among cyanobacteria are important investigative tools that might help prevention and management improvement of toxic blooms.

O crescimento desordenado das cidades tem trazido à tona problemas de saneamento e degradação dos recursos naturais, entre eles a água. O despejo de efluentes domésticos e industriais têm ocasionado a eutrofização dos mananciais, culminando com a proliferação dos fitoplânctons. Esta proliferação tem chegado ao ponto, em certos momentos, de acarretar episódios de floração de algas. Entre os organismos fitoplanctônicos que se desenvolvem no ambiente, estão as cianobactérias, com vários gêneros capazes de produzir diversas cianotoxinas, tais como as microcistinas, anatoxinas, cilindrospermopsinas (CY), saxitoxinas (PSPs), entre outras. Com o aumento da freqüência dos episódios de floração de algas, a probabilidade da ocorrência destas toxinas também aumenta. Como conseqüência disto e devido às exigências legais, os corpos dágua devem ser monitorados para garantir a qualidade da água para consumo humano. Com vistas ao monitoramento da presença das cianotoxinas CY e PSPs, foram realizadas investigações em alguns corpos dágua do Estado de São Paulo. Das investigações realizadas, a neosaxitoxina foi identificada pela primeira vez no Reservatório Billings e os congêneres, saxitoxina, goniautoxina 2, goniautoxina 3, foram identificados de forma inédita em amostras de água deste reservatório. Com relação à CY, foi desenvolvido um método analítico, parcialmente validado. Entretanto, esta cianotoxina não foi localizada nas amostras de água ou cianobactérias das águas superficiais dos corpos dágua estudados. Este estudo mostra a importância do monitoramento da qualidade das águas dos mananciais quanto à presença de cianotoxinas, especialmente daqueles corpos dágua com a finalidade do consumo humano. / Cities growth usually occur in an unorganized manner. This tendence can generate a variety of sanitary problems, including the degradation of natural resources, such as water bodies. As a consequence, domestic and industrial efluents cause eutrofication of water reservoir, increasing the natural level of phytoplancton, what may form algal bloom. Among the phytoplanktonic organisms that grow in this modified environment it is found the cyanobacteria. Some of them can produce different types of cyanotoxins such as microcystin, anatoxin, cylindrospermopsin (CY) and saxitoxin (PSPs). The probability of production of these cyanotoxins increase according to frequent occurrence of algal blooms episodes. Consequently, water bodies monitoring becomes important to assure water quality. The aim of this project was to develop a specific method to identify the presence of cyanotoxins CY and to investigate PSPs in water bodies in São Paulo State. The results confirmed the presence of neosaxitoxin (NEO), a toxin of PSPs family. It was the first time that Neo was indentified in Billings Reservoir along with other PSPs types: saxitoxin, gonyautoxin 2, gonyautoxin 3. Although the study also included CY monitoring, CY was not identified in the tested samples. The present study confirmed the importance of continuous searching and monitoring of water bodies to grant quality to water used for human consumption.

A combinação de coagulação/floculação/sedimentação, filtração lenta em escala domiciliar e adsorção foi ponderada como alternativa de tratamento de águas com Microcystis aeruginosa e microcistina para comunidades isoladas. As Cactáceas Opuntia cochenillifera e Opuntia ficus-indica foram estudadas como coagulantes e a espécie Luffa cylindrica foi estudada como adsorvente. Os coagulantes foram avaliados em ensaios em bancada com água contendo M. aeruginosa. O extrato de O. cochenillifera apresentou melhor desempenho por isso foi selecionado para ensaios de bancada em jarteste seguidos por filtração. Os filtros operados em regime contínuo apresentaram melhores resultados, na remoção de microcistina (75,79%), cor aparente (79,68%) e turbidez (79,15%). Entretanto, os filtros operados em regime intermitente demonstraram melhor eficiência na remoção de M. aeruginosa (96,62% - 1,985 Log). Os ensaios de adsorção mostraram que Luffa cilyndrica in natura, temperatura ambiente e pH neutro não apresentou potencial na adsorção de microcistina. Para os ensaios em escala plena, dois filtros lentos em escala domiciliar (FLD) em policloreto de polivinila (polyvinyl chloride - PVC) foram construídos tomando-se por base o modelo do Centre for Affordable Water and Sanitation Technology (CAWST). Um filtro foi operado em regime contínuo e o outro em regime intermitente. O coagulante e o adsorvente não foram utilizados nessa etapa do trabalho. O filtro operado em fluxo contínuo apresentou resultados superiores para a remoção de M. aeruginosa (99,59% - 1,998 log), cor aparente (97,73%) e turbidez (84,39%). O regime de operação e o tempo de residência nos filtros não influenciaram na eficiência do tratamento. A água filtrada apresentou características em consonância com as previstas na legislação para cor aparente, porém, não para turbidez. A água filtrada apresentou concentrações de microcistina abaixo de 1,0 μg L-1 para ambos os filtros, valor máximo permitido pela Portaria MS 2914/2011 e pelas diretrizes da Organização Mundial da Saúde. Em ensaios ecotoxicológicos com Chironomus xanthus, a água filtrada não apresentou toxicidade. / The combination of coagulation/flocculation/sedimentation, slow sand filtration at home scale and adsorption was evaluated as an alternative treatment for waters with Microcystis aeruginosa and microcystin for isolated communities. The Cactaceae Opuntia cochenillifera and Opuntia ficus-indica were evaluated as coagulants and the species Luffa cylindrica was evaluated as adsorbent. The coagulants were evaluated in bench tests with a study water containing M. aeruginosa cells. O. cochenillifera extract presented better removal performance so it was selected for jartest bench tests followed by filtration. The filters operated in continuous flow showed better results in microcystin removal (75.79%), apparent color (79.68%) and turbidity (79.15%). However, the intermittent flow filters demonstrated a better removal of M. aeruginosa cells (96.62% - 1985 Log). The adsorption tests showed that the use of Luffa cylindrica fibers, at ambient temperature and neutral pH had no potential in microcystin adsorption. In full-scale trials, two PVC home scale slow sand filters were constructed based on the CAWST (Center for Affordable Water and Sanitation Technology) Biosand filter model. One home scale slow sand filters was operated on a continuous flow and another on an intermittent flow. The coagulant and the adsorbent were not used at the fullscale trials. The continuous flow filter showed superior results for cyanobacteria removal (99.59% - 1.998 log), apparent color removal (97.73%) and turbidity removal (84.39%). The filters operating regime and residence time do not influenced the efficiency of the treatment. The filtered water showed characteristics in line with the legislation for apparent color, but not for turbidity. The filtered water had microcystin concentrations below 1.0 μg L-1 for the two filters, maximum value allowed by Directive 2914/2011 and by guidelines of the World Health Organization. In ecotoxicological tests with Chironomus xanthus, filtered water showed no toxicity.

A espécie de cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii pertence a ordem Nostocales e tem a capacidade de realizar a fixação biológica do N2 atmosférico, sintetizar cianotoxinas e também de proliferar em águas doces formando florações de cianobactérias nocivas. A população de C. raciborskii encontrada no Brasil é conhecida por produzir derivados de saxitoxina (STX), enquanto cilindrospermopsinas (CYN), as quais são detectadas em isolados de outros países, não têm sido detectada em isolados brasileiros. Neste estudo, a produção de CYN por dois isolados brasileiros de C. raciborskii, CENA302 e CENA303, submetidos a diferentes condições nutricionais, foi avaliada usando o teste imunológico ELISA específico para detecção de CYN. Em seguida, genes evolvidos na biossíntese de CYN foram buscados no genoma dessas duas linhagens usando amplificações por PCR com iniciadores específicos e posterior sequenciamento Sanger, bem como sequenciamento genômico na plataforma HiScan SQ. Além disso, foram realizadas buscas nos dois genomas obtidos pela plataforma HiScan SQ de genes envolvidos com a síntese de algumas outras moléculas já descritas em cianobactérias, bem como aqueles relacionados com a fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito. Apesar da utilização de diferentes condições nutricionais, não foi detectada a produção de CYN no ensaio de ELISA em ambos os isolados de cianobactérias. No sequenciamento Sanger, dos nove genes sintetases de CYN buscados, quatro foram amplificados e sequenciados na linhagem C. raciborskii CENA302 e três na linhagem CENA303. Estas sequências de nucletídeos foram traduzidas em aminoácidos, e as funções das proteínas e os domínios preditos confirmaram a sua identidade como genes sintetase de CYN. O sequenciamento dos genomas completos das duas linhagens apresentou altos valores de qualidade de bases e elevada cobertura genômica. A busca por genes sintetase de CYN nos dois genomas foi realizada pelo mapeamento por referência das leituras, mostrando que algumas porções do agrupamento estavam contempladas no genoma, representando aproximadamente 10% do agrupamento de CYN. A anotação das regiões entre os genes descritos como flanqueadores do agrupamento CYN mostrou uma inversão gênica indicando a ocorrência de eventos que podem ter levado a perda ou dispersão no genoma deste agrupamento. Os genes anotados relacionados com fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito nas linhagens CENA302 e CENA303 apresentaram altas identidades com genes homólogos descritos em C. raciborskii. A ausência de alguns nucleotídeos no gene hetP envolvido na formação do heterócito possivelmente levou a perda de sua função na C. raciborskii CENA303, impedindo a diferenciação das células vegetativas em heterócitos, uma vez que não foi observado a presença dessa célula diferenciada em nenhuma das condições nutricionais avaliadas. Todos os genes de moléculas bioativas conhecidas de cianobactérias buscados pelo mapeamento por referência das leituras não foram encontrados nos genomas das linhagens C. raciborskii CENA302 e CENA303. Os resultados obtidos neste estudo revelaram a possibilidade de estar ocorrendo eventos evolutivos que estão causando a perda dos genes responsáveis pela síntese de CYN nos isolados brasileiros de C. raciborskii, demonstrando divergência alopátrica. / The cyanobacterial species Cylindrospermopsis raciborskii belongs to the order Nostocales and has the ability to perform biological nitrogen fixation, synthesize cyanotoxins and also to proliferate in freshwaters to form harmful cyanobacterial blooms. The C. raciborskii population from Brazil is known to produces saxitoxin derivatives (STX), while cylindrospermopsin (CYN), which is commonly detected in isolates from other countries, has thus far not been detected in Brazilian strains. In this study, the production of CYN by two Brazilian isolates of C. raciborskii CENA302 and CENA303, under different nutritional conditions, was evaluated using ELISA immunoassay specific for the detection of CYN. Then, genes involved in the biosynthesis of CYN were searched in the genome of these two strains using PCR amplification with specific primers and subsequent Sanger sequencing, as well as genomic sequencing on the platform HiScan SQ. Furthermore, searches were performed in the two genomes obtained by the platform HiScan SQ of genes involved in the synthesis of several other molecules already described in cyanobacteria, as well as those related to the biological N2 fixation and heterocyte differentiation. Despite the use of different nutritional conditions, no CYN production was detected by the ELISA assay for both cyanobacterial isolates. In the Sanger sequencing, of the nine CYN synthetase gene searched, four were amplified and sequenced in the C. raciborskii strain CENA302 and three in the strain CENA303. These nucleotide sequences were translated into amino acids, and the predicted protein functions and domains confirmed their identity as CYN synthetase genes. The complete genome sequencing of the two strains showed high values of bases quality and high genomic coverage. The search for CYN synthetase genes in the two genomes was performed by mapping reads to reference, showing that some portions of the cluster were contemplated in the genome, representing approximately 10% of CYN cluster. The annotation of regions between the genes described as flanking the CYN cluster showed a gene inversion indicating the occurrence of events that may have caused the loss or dispersion in the genome of this cluster. The annotated genes related to biological N2 fixation and heterocyte differentiation in the CENA302 and CENA303 strains showed high identities with homologous genes from other strains of C. raciborskii. The absence of a few nucleotides in the hetP gene involved in the heterocyte formation perhaps led to the loss of its function in the C. raciborskii CENA303, preventing the differentiation of vegetative cells into heterocyte, since it was not observed the presence of this differentiated cell in any of the nutritional conditions evaluated. All genes of known cyanobacterial molecules searched by mapping reads to reference were not found in the genomes of the C. raciborskii strains CENA302 and CENA303. The results of this study revealed the possibility of being occurring evolutionary events that are leading to loss of the genes responsible for the synthesis of CYN in the C. raciborskii Brazilian isolates, demonstrating allopatric divergence.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-03-10T13:44:20Z No. of bitstreams: 1 PDF - Maria Natália Costa e Silva.pdf: 1280209 bytes, checksum: df5d2a51e71f30434a166906afcbecd3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-10T13:44:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Maria Natália Costa e Silva.pdf: 1280209 bytes, checksum: df5d2a51e71f30434a166906afcbecd3 (MD5) Previous issue date: 2014-08-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The greater input of nutrients, such as nitrogen and phosphorus, from various anthropogenic uses of watersheds is one of the causes of the high growth rate of algae and cyanobacteria. Algae bloom impacts the quality of water causing taste and odor problems due to chemicals and toxins, called cyanotoxins, produced by these microorganisms. This situation, observed in sources of water supply, is worrying since the conventional treatment used by 70% of the water treatment stations in Brazil are not able to effectively remove those toxins. Studies performed by research groups around Brazil have shown the coexistence of two cyanobacteria, Microcystis aeruginosa and Cylindrospermopsis raciborskii, producers of the cyanotoxins microcystin and saxitoxins, respectively, which justifies the study of the removal of these toxins concomitantly. The aim of this study was to evaluate the ranking in removing microcystin-LR and saxitoxins-STX by adsorption on granular activated carbon (GAC) from different sources and particle sizes. Two types of palm coconut shell charcoal with the following mesh sizes 8x30 (FDG) and 12x40 (FDF) were used. A mineral charcoal with a 12x25mesh (FCM) was also used. The adsorption was made by filtration columns. The cyanotoxins were extracted from cultures of pure strains of M. aeruginosa and C. raciborskii. The method used for quantification was the immunoassay ELISA. First, we analyzed the removal efficiencies of MC-LR with each type of charcoal using samples of treated and distilled water. The filters were operated at a 66.3 m 3 /m 2 .d filtration rate. The results of this first phase showed a more effective removal of FDF (67.3%), although the average removal of FCM was higher (72.3%). In the second phase of the study, we analyzed the concomitant removal of MC-LR and STX using FDF at a 35.1 m 3 /m 2 .d filtration rate. The average removals of 58.9% and 92.5%, respectively, showed that the removal of saxitoxins is better, although we cannot assume that this toxin excels in the ranking. As for the difference between the filtration rates, we found that the removal is better with filters operating at a lower rate. / O aporte maior de nutrientes como nitrogênio e fósforo provenientes dos diversos usos antrópicos das bacias hidrográficas é um dos responsáveis pela alta taxa de crescimento de algas e cianobactérias. O bloom desses microrganismos modifica a qualidade da água, produzindo substâncias que conferem gosto e odor à água e até mesmo substâncias tóxicas, como as cianotoxinas. Essa situação presente nos mananciais de abastecimento é preocupante uma vez que o tratamento convencional utilizado por 70% das estações de tratamento de água no Brasil não são efetivamente capazes de remover tais substâncias tóxicas. O registro por grupos de pesquisa em todo país da presença conjunta de cianobactérias como a Microcystis aeruginosa e Cylindrospermopsis raciborskii, potencialmente produtoras das cianotoxinas microcistinas e saxitoxinas, respectivamente, justifica o estudo da remoção dessas toxinas em concomitância. O carvão ativado granular (CAG) é a tecnologia de tratamento avançado utilizada nesse trabalho que objetiva avaliar a hierarquização da remoção de microcistina-LR e saxitoxina STX por meio da adsorção em CAG de natureza e granulometrias distintas. Foram utilizadas colunas de filtração com dois carvões de casca de coco de dendê com granulometrias 8x30mesh (FDG) e 12x40mesh (FDF) e um carvão mineral com granulometria 12x25mesh (FCM). As cianotoxinas foram extraídas de cultivos de cepas puras de M. aeruginosa e C. raciborakii potencialmente produtoras e foi utilizado o método por imunoensaio ELISA para quantificação. Primeiramente foram analisadas as eficiências de remoção de MC-LR em cada tipo de carvão com águas de estudo formadas por água tratada e água destilada. Os filtros foram operados com taxa de filtração 66,3m³/m².d e os resultados dessa etapa evidenciaram remoção mais efetiva para o FDF (67,3%) apesar de a remoção média do FCM (72,3%) ter sido maior. Na segunda etapa do trabalho foi analisada a remoção em concomitância de MC-LR e STX e utilizou-se o FDF a uma taxa de 35,1m³/m².d em que as médias de remoção de 58,9% e 92,5%, respectivamente, evidenciaram que a saxitoxina apresenta melhor remoção, mas não se pode assumir que sobressai nessa hierarquia. Quanto à diferença nas taxas de filtração aplicadas, encontrou-se melhor remoção nos filtros operados com menor taxa.