16S rDNA sequences from 23 heterocytous cyanobacteria were obtained and phylogenetic tree from these sequences and sequences available in the GenBank was constructed. Relationships between traditional taxonomy and phylogenetic clusters were discussed.

Cianobactérias são micro-organismos que realizam fotossíntese oxigênica e têm uma distribuição cosmopolita. Algumas cianobactérias são capazes de realizar fotossíntese e fixação biológica de nitrogênio (FBN), dois dos mais importantes processos na natureza, simultaneamente. As cianobactérias da ordem Nostocales são capazes realizar uma separação espacial destes dois processos por meio da formação de células especializadas, os heterócitos, onde acontece a fixação de nitrogênio, restringindo a fotossíntese às células vegetativas. Embora tenham importância ecológica, econômica e social, as cianobactérias foram muito pouco estudas com enfoque genômico. Este trabalho teve como objetivo a caracterização dos agrupamentos gênicos envolvidos na fixação biológica de nitrogênio e na diferenciação de heterócitos de três isolados brasileiros de cianobactérias da ordem Nostocales. Para este fim, culturas das linhagens Sphaerospermopsis torquesreginae ITEP-024, Nostoc sp. CENA67 e Fischerella sp. CENA161 foram sequenciadas com a plataforma MiSeq e então foi realizada a montagem ab initio do genoma com as leituras obtidas. Além desses três isolados, os genomas de outras 31 linhagens disponíveis no banco de dados GenBank foram recuperados e utilizados para comparação. A anotação dos genes foi realizada por meio do alinhamento de sequências nucleotídicas já conhecidas de outras linhagens contra os genomas dessas linhagens, utilizando a ferramenta BLASTn, e por meio do servidor antiSMASH. Além disso, análises filogenéticas foram realizadas a partir dos genes anotados. O sequenciamento dos genomas das três linhagens apresentou altos valores de qualidade de bases e elevada cobertura genômica. A anotação dos agrupamentos envolvidos na FBN revelou a presença de um total de 22 genes envolvidos na síntese da Mo-nitrogenase, sendo 19 presentes em todas as linhagens. Os isolados brasileiros apresentaram sintenia com outras linhagens próximas filogeneticamente, apresentando variação apenas na presença de regiões de excisão e do gene glbN. A linhagem CENA161 apresentou um agrupamento gênico completo para síntese da V-nitrogenase, assim como apenas outras 5 linhagens em toda a ordem. Foram encontradas nas três linhagens sequenciadas os genes devACB, relacionados à formação da camada polissacarídica do heterócito. Os genes hglEGDCA e hetM, que estão relacionados à formação da camada glicolipídica de heterócitos, foram encontrados completos nas linhagens ITEP-024 e CENA67, mas apenas parcialmente na CENA161. Genes reguladores do processo de diferenciação também foram acessados nas três linhagens brasileiras, entretanto apenas os reguladores globais do processo formam encontrados em CENA161. As análises filogenéticas mostraram que o gene nifH não reflete a filogenia do táxon e não é um bom marcador filogenético. Entretanto, a análise de todo o agrupamento refletiu o padrão filogenético de acordo com a taxonomia. Os resultados contribuem para a melhor compreensão dos aspectos genéticos e evolutivos do processo de FBN em cianobactérias. / Cyanobacteria are oxygenic photosynthetic microorganisms that have a worldwide distribution. Some cyanobacteria are capable of photosynthesis and biological nitrogen fixation (BNF), two of the most important processes in nature, simultaneously. Cyanobacteria from the Nostocales order perform a spatial separation of these processes through the formation of specialized cells, heterocytes, where nitrogen fixation is carried out, while photosynthesis is limited to vegetative cells. Although cyanobacterial have ecological, economic and social importance, they have been understudied with genomic approaches. This study aimed to characterize gene clusters involved in nitrogen fixation and heterocytes differentiation from three Brazilian strains of cyanobacteria from Nostocales order. For this purpose, nonaxenic cultures of the strains Sphaerospermopsis torque-reginae ITEP-024, Nostoc sp. CENA67 and Fischerella sp. CENA161 were sequenced with the Illumina MiSeq platform and ab initio genome assembly was performed. In addition to these strains, genomes from 31 strains available in the GenBank database were retrieved and used for comparison. Gene annotation was performed through alignments between known genes present in other cyanobacteria and the strains genomes, using the BLASTn tool, and through the antiSMASH server. Furthermore, phylogenetic analyses were performed on the annotated genes. The genome sequencing showed high bases quality values and genomic coverage. The annotation of clusters involved in the BNF revealed the presence of a total of 22 genes involved in the synthesis of Mo-nitrogenase, among 19 were present in all strains. Brazilian isolates showed synteny with phylogenetically related strains, with variations only in the presence of excision regions and glbN gene. The CENA161 strain showed a complete gene cluster for synthesis of V-nitrogenase, present in only 5 other strains in this order. devACB genes, related to the heterocyte polysaccharide layer formation, were found in the three strains sequenced. The hglEGDCA and hetM genes, related to the formation of heterocyte glycolipid layer, were complete in ITEP-024 and CENA67 strains, but only partial in CENA161. Gene regulation of the heterocyte differentiation process have also been accessed in the three Brazilian strains, but only the general process regulatory genes were found in CENA161. Phylogenetic analysis showed that the gene nifH does not reflect the phylogeny of this group and should not be considered a good phylogenetic marker. However, the complete genes cluster analysis reflected the patterns of phylogenetic grouping according to taxonomy. The results contribute to a better understanding of the genetic and evolutionary aspects of the BNF process in cyanobacteria.

Cianobactérias são micro-organismos que realizam fotossíntese oxigênica e têm uma distribuição cosmopolita. Algumas cianobactérias são capazes de realizar fotossíntese e fixação biológica de nitrogênio (FBN), dois dos mais importantes processos na natureza, simultaneamente. As cianobactérias da ordem Nostocales são capazes realizar uma separação espacial destes dois processos por meio da formação de células especializadas, os heterócitos, onde acontece a fixação de nitrogênio, restringindo a fotossíntese às células vegetativas. Embora tenham importância ecológica, econômica e social, as cianobactérias foram muito pouco estudas com enfoque genômico. Este trabalho teve como objetivo a caracterização dos agrupamentos gênicos envolvidos na fixação biológica de nitrogênio e na diferenciação de heterócitos de três isolados brasileiros de cianobactérias da ordem Nostocales. Para este fim, culturas das linhagens Sphaerospermopsis torquesreginae ITEP-024, Nostoc sp. CENA67 e Fischerella sp. CENA161 foram sequenciadas com a plataforma MiSeq e então foi realizada a montagem ab initio do genoma com as leituras obtidas. Além desses três isolados, os genomas de outras 31 linhagens disponíveis no banco de dados GenBank foram recuperados e utilizados para comparação. A anotação dos genes foi realizada por meio do alinhamento de sequências nucleotídicas já conhecidas de outras linhagens contra os genomas dessas linhagens, utilizando a ferramenta BLASTn, e por meio do servidor antiSMASH. Além disso, análises filogenéticas foram realizadas a partir dos genes anotados. O sequenciamento dos genomas das três linhagens apresentou altos valores de qualidade de bases e elevada cobertura genômica. A anotação dos agrupamentos envolvidos na FBN revelou a presença de um total de 22 genes envolvidos na síntese da Mo-nitrogenase, sendo 19 presentes em todas as linhagens. Os isolados brasileiros apresentaram sintenia com outras linhagens próximas filogeneticamente, apresentando variação apenas na presença de regiões de excisão e do gene glbN. A linhagem CENA161 apresentou um agrupamento gênico completo para síntese da V-nitrogenase, assim como apenas outras 5 linhagens em toda a ordem. Foram encontradas nas três linhagens sequenciadas os genes devACB, relacionados à formação da camada polissacarídica do heterócito. Os genes hglEGDCA e hetM, que estão relacionados à formação da camada glicolipídica de heterócitos, foram encontrados completos nas linhagens ITEP-024 e CENA67, mas apenas parcialmente na CENA161. Genes reguladores do processo de diferenciação também foram acessados nas três linhagens brasileiras, entretanto apenas os reguladores globais do processo formam encontrados em CENA161. As análises filogenéticas mostraram que o gene nifH não reflete a filogenia do táxon e não é um bom marcador filogenético. Entretanto, a análise de todo o agrupamento refletiu o padrão filogenético de acordo com a taxonomia. Os resultados contribuem para a melhor compreensão dos aspectos genéticos e evolutivos do processo de FBN em cianobactérias. / Cyanobacteria are oxygenic photosynthetic microorganisms that have a worldwide distribution. Some cyanobacteria are capable of photosynthesis and biological nitrogen fixation (BNF), two of the most important processes in nature, simultaneously. Cyanobacteria from the Nostocales order perform a spatial separation of these processes through the formation of specialized cells, heterocytes, where nitrogen fixation is carried out, while photosynthesis is limited to vegetative cells. Although cyanobacterial have ecological, economic and social importance, they have been understudied with genomic approaches. This study aimed to characterize gene clusters involved in nitrogen fixation and heterocytes differentiation from three Brazilian strains of cyanobacteria from Nostocales order. For this purpose, nonaxenic cultures of the strains Sphaerospermopsis torque-reginae ITEP-024, Nostoc sp. CENA67 and Fischerella sp. CENA161 were sequenced with the Illumina MiSeq platform and ab initio genome assembly was performed. In addition to these strains, genomes from 31 strains available in the GenBank database were retrieved and used for comparison. Gene annotation was performed through alignments between known genes present in other cyanobacteria and the strains genomes, using the BLASTn tool, and through the antiSMASH server. Furthermore, phylogenetic analyses were performed on the annotated genes. The genome sequencing showed high bases quality values and genomic coverage. The annotation of clusters involved in the BNF revealed the presence of a total of 22 genes involved in the synthesis of Mo-nitrogenase, among 19 were present in all strains. Brazilian isolates showed synteny with phylogenetically related strains, with variations only in the presence of excision regions and glbN gene. The CENA161 strain showed a complete gene cluster for synthesis of V-nitrogenase, present in only 5 other strains in this order. devACB genes, related to the heterocyte polysaccharide layer formation, were found in the three strains sequenced. The hglEGDCA and hetM genes, related to the formation of heterocyte glycolipid layer, were complete in ITEP-024 and CENA67 strains, but only partial in CENA161. Gene regulation of the heterocyte differentiation process have also been accessed in the three Brazilian strains, but only the general process regulatory genes were found in CENA161. Phylogenetic analysis showed that the gene nifH does not reflect the phylogeny of this group and should not be considered a good phylogenetic marker. However, the complete genes cluster analysis reflected the patterns of phylogenetic grouping according to taxonomy. The results contribute to a better understanding of the genetic and evolutionary aspects of the BNF process in cyanobacteria.

A espécie de cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii pertence a ordem Nostocales e tem a capacidade de realizar a fixação biológica do N2 atmosférico, sintetizar cianotoxinas e também de proliferar em águas doces formando florações de cianobactérias nocivas. A população de C. raciborskii encontrada no Brasil é conhecida por produzir derivados de saxitoxina (STX), enquanto cilindrospermopsinas (CYN), as quais são detectadas em isolados de outros países, não têm sido detectada em isolados brasileiros. Neste estudo, a produção de CYN por dois isolados brasileiros de C. raciborskii, CENA302 e CENA303, submetidos a diferentes condições nutricionais, foi avaliada usando o teste imunológico ELISA específico para detecção de CYN. Em seguida, genes evolvidos na biossíntese de CYN foram buscados no genoma dessas duas linhagens usando amplificações por PCR com iniciadores específicos e posterior sequenciamento Sanger, bem como sequenciamento genômico na plataforma HiScan SQ. Além disso, foram realizadas buscas nos dois genomas obtidos pela plataforma HiScan SQ de genes envolvidos com a síntese de algumas outras moléculas já descritas em cianobactérias, bem como aqueles relacionados com a fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito. Apesar da utilização de diferentes condições nutricionais, não foi detectada a produção de CYN no ensaio de ELISA em ambos os isolados de cianobactérias. No sequenciamento Sanger, dos nove genes sintetases de CYN buscados, quatro foram amplificados e sequenciados na linhagem C. raciborskii CENA302 e três na linhagem CENA303. Estas sequências de nucletídeos foram traduzidas em aminoácidos, e as funções das proteínas e os domínios preditos confirmaram a sua identidade como genes sintetase de CYN. O sequenciamento dos genomas completos das duas linhagens apresentou altos valores de qualidade de bases e elevada cobertura genômica. A busca por genes sintetase de CYN nos dois genomas foi realizada pelo mapeamento por referência das leituras, mostrando que algumas porções do agrupamento estavam contempladas no genoma, representando aproximadamente 10% do agrupamento de CYN. A anotação das regiões entre os genes descritos como flanqueadores do agrupamento CYN mostrou uma inversão gênica indicando a ocorrência de eventos que podem ter levado a perda ou dispersão no genoma deste agrupamento. Os genes anotados relacionados com fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito nas linhagens CENA302 e CENA303 apresentaram altas identidades com genes homólogos descritos em C. raciborskii. A ausência de alguns nucleotídeos no gene hetP envolvido na formação do heterócito possivelmente levou a perda de sua função na C. raciborskii CENA303, impedindo a diferenciação das células vegetativas em heterócitos, uma vez que não foi observado a presença dessa célula diferenciada em nenhuma das condições nutricionais avaliadas. Todos os genes de moléculas bioativas conhecidas de cianobactérias buscados pelo mapeamento por referência das leituras não foram encontrados nos genomas das linhagens C. raciborskii CENA302 e CENA303. Os resultados obtidos neste estudo revelaram a possibilidade de estar ocorrendo eventos evolutivos que estão causando a perda dos genes responsáveis pela síntese de CYN nos isolados brasileiros de C. raciborskii, demonstrando divergência alopátrica. / The cyanobacterial species Cylindrospermopsis raciborskii belongs to the order Nostocales and has the ability to perform biological nitrogen fixation, synthesize cyanotoxins and also to proliferate in freshwaters to form harmful cyanobacterial blooms. The C. raciborskii population from Brazil is known to produces saxitoxin derivatives (STX), while cylindrospermopsin (CYN), which is commonly detected in isolates from other countries, has thus far not been detected in Brazilian strains. In this study, the production of CYN by two Brazilian isolates of C. raciborskii CENA302 and CENA303, under different nutritional conditions, was evaluated using ELISA immunoassay specific for the detection of CYN. Then, genes involved in the biosynthesis of CYN were searched in the genome of these two strains using PCR amplification with specific primers and subsequent Sanger sequencing, as well as genomic sequencing on the platform HiScan SQ. Furthermore, searches were performed in the two genomes obtained by the platform HiScan SQ of genes involved in the synthesis of several other molecules already described in cyanobacteria, as well as those related to the biological N2 fixation and heterocyte differentiation. Despite the use of different nutritional conditions, no CYN production was detected by the ELISA assay for both cyanobacterial isolates. In the Sanger sequencing, of the nine CYN synthetase gene searched, four were amplified and sequenced in the C. raciborskii strain CENA302 and three in the strain CENA303. These nucleotide sequences were translated into amino acids, and the predicted protein functions and domains confirmed their identity as CYN synthetase genes. The complete genome sequencing of the two strains showed high values of bases quality and high genomic coverage. The search for CYN synthetase genes in the two genomes was performed by mapping reads to reference, showing that some portions of the cluster were contemplated in the genome, representing approximately 10% of CYN cluster. The annotation of regions between the genes described as flanking the CYN cluster showed a gene inversion indicating the occurrence of events that may have caused the loss or dispersion in the genome of this cluster. The annotated genes related to biological N2 fixation and heterocyte differentiation in the CENA302 and CENA303 strains showed high identities with homologous genes from other strains of C. raciborskii. The absence of a few nucleotides in the hetP gene involved in the heterocyte formation perhaps led to the loss of its function in the C. raciborskii CENA303, preventing the differentiation of vegetative cells into heterocyte, since it was not observed the presence of this differentiated cell in any of the nutritional conditions evaluated. All genes of known cyanobacterial molecules searched by mapping reads to reference were not found in the genomes of the C. raciborskii strains CENA302 and CENA303. The results of this study revealed the possibility of being occurring evolutionary events that are leading to loss of the genes responsible for the synthesis of CYN in the C. raciborskii Brazilian isolates, demonstrating allopatric divergence.

A espécie de cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii pertence a ordem Nostocales e tem a capacidade de realizar a fixação biológica do N2 atmosférico, sintetizar cianotoxinas e também de proliferar em águas doces formando florações de cianobactérias nocivas. A população de C. raciborskii encontrada no Brasil é conhecida por produzir derivados de saxitoxina (STX), enquanto cilindrospermopsinas (CYN), as quais são detectadas em isolados de outros países, não têm sido detectada em isolados brasileiros. Neste estudo, a produção de CYN por dois isolados brasileiros de C. raciborskii, CENA302 e CENA303, submetidos a diferentes condições nutricionais, foi avaliada usando o teste imunológico ELISA específico para detecção de CYN. Em seguida, genes evolvidos na biossíntese de CYN foram buscados no genoma dessas duas linhagens usando amplificações por PCR com iniciadores específicos e posterior sequenciamento Sanger, bem como sequenciamento genômico na plataforma HiScan SQ. Além disso, foram realizadas buscas nos dois genomas obtidos pela plataforma HiScan SQ de genes envolvidos com a síntese de algumas outras moléculas já descritas em cianobactérias, bem como aqueles relacionados com a fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito. Apesar da utilização de diferentes condições nutricionais, não foi detectada a produção de CYN no ensaio de ELISA em ambos os isolados de cianobactérias. No sequenciamento Sanger, dos nove genes sintetases de CYN buscados, quatro foram amplificados e sequenciados na linhagem C. raciborskii CENA302 e três na linhagem CENA303. Estas sequências de nucletídeos foram traduzidas em aminoácidos, e as funções das proteínas e os domínios preditos confirmaram a sua identidade como genes sintetase de CYN. O sequenciamento dos genomas completos das duas linhagens apresentou altos valores de qualidade de bases e elevada cobertura genômica. A busca por genes sintetase de CYN nos dois genomas foi realizada pelo mapeamento por referência das leituras, mostrando que algumas porções do agrupamento estavam contempladas no genoma, representando aproximadamente 10% do agrupamento de CYN. A anotação das regiões entre os genes descritos como flanqueadores do agrupamento CYN mostrou uma inversão gênica indicando a ocorrência de eventos que podem ter levado a perda ou dispersão no genoma deste agrupamento. Os genes anotados relacionados com fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito nas linhagens CENA302 e CENA303 apresentaram altas identidades com genes homólogos descritos em C. raciborskii. A ausência de alguns nucleotídeos no gene hetP envolvido na formação do heterócito possivelmente levou a perda de sua função na C. raciborskii CENA303, impedindo a diferenciação das células vegetativas em heterócitos, uma vez que não foi observado a presença dessa célula diferenciada em nenhuma das condições nutricionais avaliadas. Todos os genes de moléculas bioativas conhecidas de cianobactérias buscados pelo mapeamento por referência das leituras não foram encontrados nos genomas das linhagens C. raciborskii CENA302 e CENA303. Os resultados obtidos neste estudo revelaram a possibilidade de estar ocorrendo eventos evolutivos que estão causando a perda dos genes responsáveis pela síntese de CYN nos isolados brasileiros de C. raciborskii, demonstrando divergência alopátrica. / The cyanobacterial species Cylindrospermopsis raciborskii belongs to the order Nostocales and has the ability to perform biological nitrogen fixation, synthesize cyanotoxins and also to proliferate in freshwaters to form harmful cyanobacterial blooms. The C. raciborskii population from Brazil is known to produces saxitoxin derivatives (STX), while cylindrospermopsin (CYN), which is commonly detected in isolates from other countries, has thus far not been detected in Brazilian strains. In this study, the production of CYN by two Brazilian isolates of C. raciborskii CENA302 and CENA303, under different nutritional conditions, was evaluated using ELISA immunoassay specific for the detection of CYN. Then, genes involved in the biosynthesis of CYN were searched in the genome of these two strains using PCR amplification with specific primers and subsequent Sanger sequencing, as well as genomic sequencing on the platform HiScan SQ. Furthermore, searches were performed in the two genomes obtained by the platform HiScan SQ of genes involved in the synthesis of several other molecules already described in cyanobacteria, as well as those related to the biological N2 fixation and heterocyte differentiation. Despite the use of different nutritional conditions, no CYN production was detected by the ELISA assay for both cyanobacterial isolates. In the Sanger sequencing, of the nine CYN synthetase gene searched, four were amplified and sequenced in the C. raciborskii strain CENA302 and three in the strain CENA303. These nucleotide sequences were translated into amino acids, and the predicted protein functions and domains confirmed their identity as CYN synthetase genes. The complete genome sequencing of the two strains showed high values of bases quality and high genomic coverage. The search for CYN synthetase genes in the two genomes was performed by mapping reads to reference, showing that some portions of the cluster were contemplated in the genome, representing approximately 10% of CYN cluster. The annotation of regions between the genes described as flanking the CYN cluster showed a gene inversion indicating the occurrence of events that may have caused the loss or dispersion in the genome of this cluster. The annotated genes related to biological N2 fixation and heterocyte differentiation in the CENA302 and CENA303 strains showed high identities with homologous genes from other strains of C. raciborskii. The absence of a few nucleotides in the hetP gene involved in the heterocyte formation perhaps led to the loss of its function in the C. raciborskii CENA303, preventing the differentiation of vegetative cells into heterocyte, since it was not observed the presence of this differentiated cell in any of the nutritional conditions evaluated. All genes of known cyanobacterial molecules searched by mapping reads to reference were not found in the genomes of the C. raciborskii strains CENA302 and CENA303. The results of this study revealed the possibility of being occurring evolutionary events that are leading to loss of the genes responsible for the synthesis of CYN in the C. raciborskii Brazilian isolates, demonstrating allopatric divergence.