Orientador: Patrícia Parise Pasquali-Maltempi / Resumo: Os anfíbios anuros correspondem ao segundo grupo de vertebrados com maior número de espécies, perdendo apenas para os peixes. Só no Brasil são mais de 1000 espécies descritas, com novas descrições e revalidações acontecendo todo ano. Esse grupo está envolvido em diversas problemáticas taxonômicas, em parte por ser altamente polimórfico e ao mesmo tempo conter muitas espécies crípticas, em parte por ainda haver muitas lacunas no conhecimento acerca desse grupo, dado o tamanho da sua diversidade. Resolver problemáticas envolvendo esse grupo de vertebrados é fundamental para melhor estimar o tamanho real dessa diversidade, entender os caminhos evolutivos e as relações filogenéticas no grupo e poder auxiliar na conservação das espécies, traçando planos de manejo adequados, já que o declínio de anfíbios devido à perda e fragmentação de habitat, contaminação de ambientes naturais e disseminação de doenças tem aumentado vertiginosamente. Para isso, a taxonomia moderna conta com a soma de diferentes informações a respeito dos grupos, além dos dados morfológicos já tradicionalmente utilizados. Uma das áreas que tem se mostrado promissora como uma ferramenta de auxílio na taxonomia é a citogenética, especialmente depois do advento da citogenômica, além da sua importância para o entendimento da evolução cromossômica dos grupos. No entanto, trabalhos citogenéticos, especialmente aqueles aliados à biologia molecular, são escassos em anuros. Seguindo essa linha, esse trabalho buscou obter ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Anuran amphibians corresponds to one of the most diverse vertebrate groups, second only to fishes. In Brazil alone there are more than 1000 described species, with new descriptions and revalidations happening every year. This group is involved in several taxonomic issues, partially because it is highly polymorphic and at the same time contains many cryptic species, partially because there are still many gaps in knowledge about this group, given the size of its diversity. To solve these problems is a fundamental step to better estimate its true size, to understand the evolutionary pathways and phylogenetic relationships in the group and also to be able to contribute to the conservation of the species by helping to draw appropriate management plans, as the decline of amphibians due to habitat loss and fragmentation, contamination of natural environments and the spread of disease has increased dramatically. For this, modern taxonomy relies on the sum of different data about the groups, besides the morphological data traditionally used. One of the areas that has shown promise as a taxonomy tool is cytogenetics, especially after the advent of cytogenomics, in addition to its importance for understanding the chromosomal evolution of groups. However, cytogenetic studies, especially those allied to molecular biology, are scarce in anurans. Following this line, this work sought, through the cytogenetic study, using conventional molecular markers, and cytogenomic, with the help of bioi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Thesis (PhD (Botany and Zoology)) -- University of Stellenbosch, 2008. / Afrosoricida is a 65 million years old (my) eutherian order that together with the Tubulidentata (aardvark) and Macroscelidea (elephant shrews) form the Afroinsectiphillia, a subclade of Afrotheria. It includes two families – Chrysochloridae (nine genera of golden moles) and Tenrecidae (11 genera of tenrecs) – that collectively represent ~59% of the afrotherian generic diversity. This study presents the first comprehensive cytogenetic comparison between members of these two families (seven genera and 11 species/subspecies of golden moles, and two genera and 11 species of tenrecs) using G- and C-banding and chromosome painting. All detected rearrangements are interpreted in a strict cladistic framework. In the case of Chrysochloridae, this provides evidence for a sister relationship between Chrysochloris and Cryptochloris, the monophyly of the Amblysomus genus, and for the elevation of A. hottentotus meesteri to specific rank. The detection of telomeric-like repeats in the centromeres of all chromosomes of the Amblysomus species/subspecies but not in those of A. h. meesteri further strengthens its recognition as a distinct species. Parsimony analysis of chromosomal rearrangements within Tenrecidae, the second Afrotheria assemblage studied, showed that rearrangements which could be interpreted as Whole Arm Reciprocal Translocations (WARTs) were more likely to be the result of Robertsonian translocations. Four interspecific associations are recovered within Microgale that are consistent with morphological and molecular characters. It was also possible to infer ancestral karyotypes for the Chrysochloridae, Oryzorictinae and the two tenrecid genera, Oryzorictes and Microgale. Given the relatively high karyotypic diversity observed among some Microgale species and the prevailing debates on chromosomal evolution and regional palaeoenvironmental fluctuations, it is suggested that Microgale be added to the list of taxa where structural rearrangements are likely to have played a role in speciation. Using Genbank sequences and a relaxed Bayesian clock method, we estimate the age of the family Chrysochloridae at ~28.5 my and that of the genus Microgale at ~9.9 my. Based on these dates, it can be shown that most of the evolutionary branches are characterized by a slow rate of chromosomal change, but that markedly high rates are observed in some Microgale species and to a lesser extent in the lineage leading to A. robustus. The rates of chromosomal evolution and other cytogenetic features highlighted in this study are discussed in light of recent advances in understanding the molecular mechanims that underpin changes to genomic architecture.

Metodologias de sequenciamento do genoma total para investigação de diferentes tipos de câncer detectaram recentemente uma nova classe de alterações caóticas de DNA, denominada Chromothripsis. Este fenômeno de instabilidade genômica é relativamente comum em tumores de Osteossarcoma (OS), mas existem poucos estudos que expliquem esta conexão ou abordem suas causas e consequências. A presente tese iniciou-se com a re-análise de microarrays de dez amostras de OS pediátrico, previamente processadas pelo nosso laboratório, para avaliar a variação de número de cópias de DNA (CNVs). Usando ferramentas de detecção de padrões característicos de Chromothripsis (CTLPs), encontramos 3 amostras de OS com Chromothripsis , que afetaram quatro cromossomos (2, 10, 14 e 20). As amostras com presença de Chromothripsis tiveram uma media de 468 CNVs/amostra, enquanto o grupo sem o fenômeno teve uma média de 255 CNVs/amostra. Após essa avaliação de CNVs, comparamos os níveis de expressão de RNA entre duas amostras com a presença e quatro tumores com ausência de Chromothripsis. Cerca de 171 genes estão presentes em regiões de CNVs diferentes entre os grupos avaliados. Destes, a maioria (77 genes) são relacionados com funções de comunicação celular e ao ciclo celular. Um grupo de 43 genes foi relacionado às vias de processo metabólico (principalmente associado ao metabolismo do RNA) e 27 genes associados à organização do componente celular ou biogênese. Tumores com Chromothripsis possuiam 4 genes do sistema imune menos expressos (CADM1; CLEC4A; CCR1; CD164) e 12 estavam superexpressos (IL32, LAT, BCL3, FCAR, RFX1, ILIB, CXCL1, SPON2, CCR6, IL6, SEMA3C, GEM). Os genes pouco expressos também têm um papel na via de adesão celular. A adesão celular está associada à progressão do câncer e metástase. Em seguida, re-analisamos as CNVs de 82 amostras de OS e 35 linhagens celulares de OS, usando microarrays disponíveis em bancos de dados públicos (GEO e arrayexpress), para identificar potenciais regiões cromossômicas comumente envolvidas em alterações caóticas no número de cópias de DNA, especialmente CTLPs. Identificamos Chromothripsis em 27 amostras (11 tumores e 16 linhagens), afetando 17 cromossomos diferentes. Os cromossomos 2, 8 e 12 foram alvos frequentes de Chromothripsis em OS. Em seguida, foram analisados dados de sequenciamento WGS de 12 tumores de OS disponíveis no banco de dados online dbGaP. Fizemos a avaliação da variação de número de cópias para caracterizar detalhadamente as alterações caóticas e identificar asregiões cromossômicas alvo envolvidas nas regiões de alterações caóticas no número de cópias do DNA. Encontramos CTPLs em 7 (58%) das 12 amostras de OS analisadas, usando dados de sequenciamento total. Foram encontrados 12 cromossomos diferentes afetados pelo fenômeno de alteração caótica. CTPLs foram detectadas em 62,5% das amostras de pacientes que faleceram em decorrência deste tumor. Os cromossomos 1, 3 e 7 foram um pouco mais afetados por Chromothripsis nas amostras disponibilizadas pelo dbGaP. Além disso, os cromossomos 2 e 12 também foram afetados por Chromothripsis nessas amostras. Cerca de 700 genes/tumor foram encontrados nas regiões de CTLPs. Um total de 101 genes foram localizados em regiões de alteração de número de cópias que distinguem os grupos com e sem Chromothripsis. Estes genes estão relacionados com vias de processo celular (45 genes - os quais 17 estão associados à comunicação celular) e processo metabólico (22 genes - os quais 19 estão associados ao processo metabólico primário). Nós também comparamos os níveis de expressão gênica das amostras disponíbilizadas pelo dbGap, em que foram avaliados dados de expressão de 6 amostras de RNA de OS com Chromothripsis e de 3 amostras de RNA de OS sem Chromothripsis . Diferentes algoritmos e ferramentas foram utilizadas para avaliação de RNA. Nós analisamos os dados de expressão por dois diferentes mecanismos: EdgeR e Nexus Expression. Ambos mostraram menor expressão de RNA nas vias de comunicação celular e processo metabólico primário em amostras com Chromothripsis. Os genes com regulação negativa da resposta do sistema imunológico foram encontrados em ambas ferramentas (COL8A1, CCL25). Para estudar os cromossomos envolvidos na formação de micronúcleos na linhagem celular U2OS, foram investigados erros na divisão celular induzidos por drogas (durante a anáfase). Esta etapa foi realizada durante o período de doutorado sanduíche, no Barts Cancer Institute, em Londres-UK. Os cromossomos com erros durante a anáfase foram contados por meio da técnica de FISH centromérica. Os cromossomos mais comumente encontrados com erros foram Chr2, Chr6, Chr11 e Chr12. Estes dados corroboram a ideia de que alguns cromossomos são mais suscetíveis a erros de divisão celular e colaboram para maiores índices de CTPLs em certos tumores. O fenômeno Chromothripsis parece estar presente em pelo menos 30% dos tumores de osteossarcoma e pode estar contribuindo para o fenótipo mais agressivo deste tumor ósseo. / Whole genome sequencing methods applied to a number of human cancers have detected a new class of chaotic DNA alterations in tumors called Chromothripsis. This mechanism of genomic instability is relatively common in the human bone tumor osteosarcoma (OS), but there are few studies in this tumor addressing either its causes or consequences. In this thesis we initially re-analyzed the DNA copy number data using newer software designed to detect signatures of Chromothripsis-like Patterns (CTLPs) using ten OS samples previously studied by our laboratory. We found three of the osteosarcomas had Chromothripsis signatures that affected four chromosomes (2, 10, 14 and 20). The osteosarcomas with Chromothripsis had a median of 468 copy number abnormalities per tumor compared to 255 for OS tumors without Chromothripsis. Next, we compared global RNA expression levels from two OS samples with Chromothripsis to four tumors without Chromothripsis to determine the types of gene expression differences associated with this process. We found that 171 genes mapped to regions of Chromothripsis with the majority (77 genes) mainly having functions related to cellular communication and cell cycle. There were 43 genes that were related to metabolic process (mainly associated with RNA metabolism) and 27 genes with cellular component organization or biogenesis. Also, there were four genes associated with the immune system that were underexpressed (CADM1; CLEC4A; CCR1; CD164) and 12 were overexpressed (IL32, LAT, BCL3, FCAR, RFX1, ILIB, CXCL1, SPON2, CCR6, IL6, SEMA3C, GEM) in the Chromothripsis tumors. Interestingly, all the genes underexpressed also have a role in cell adhesion pathway. Cell adhesion is associated with cancer progression and metastasis. We then reanalyzed DNA copy number data from 82 OS tumors and 35 OS cell lines using microarrays datasets available in public databanks (GEO and arrayexpress), to identify potential chromosomal regions commonly involved in chaotic DNA copy number alterations, especially CTLPs. We found Chromothripsis in 27 OS samples (11 tumors and 16 cell lines), affecting 17 different chromosomes. Chromosomes 2, 8 and 12 were frequent targets of Chromothripsis in OS. Sequentially, the DNA copy number alterations were analyzed using whole genome sequence data of 12 OS tumors available from dbGaP databank to characterize chaotic alterations in detail and identify the target chromosomal regions involved in Chromothripsis. We found Chromothripsis patterns in 7 (58%) of the 12 OS samples analyzed using whole genome sequence data. In total there were12 different chromosomes involved affecting 62.5% of samples from patients that died from OS. Chromosomes 1, 2, 3, 7 and 12 were slightly more often Chromothripsis target locations. Nearly 700 genes per tumor were found in the CTLPs regions. A total of 101 genes were located in regions of copy number change that distinguished the group of OS with Chromothripsis in comparison to OS without Chromothripsis. These genes are related with cellular process (45 genes - which 17 are associated with cell communication) and metabolic process (22 genes - which 19 are associated with primary metabolic process). We were also able to compare the RNA levels from the dbGap samples when expression data was available: comparing 6 OS RNA samples with Chromothripsis to 3 OS RNA samples without Chromothripsis. Both the EdgeR and Nexus Expression pipelines showed downregulation in cell communication pathway and primary metabolic process in samples with Chromothripsis. Genes downregulated of immune system response pathway were found in both pipeline (COL8A1, CCL25). To study the chromosomes involved in micronucleus formation in the OS cell line U2OS, errors in cell division induced by drugs during the anaphase were evaluated during the sandwich period at Barts Cancer Institute in London-UK. The lagging chromosomes were counted and the most common chromosomes with errors were Chr2, Chr6, Chr11, and Chr12. These data provide further support to the idea that some chromosomes are more susceptible to cell division errors and corroborate with the chromosomes affected by CTPLs in some tumors.

Rearranjos cromossômicos estruturais estão potencialmente associados ao desenvolvimento de doenças genéticas devido à disrupção, inativação ou alteração da dosagem gênica. O objetivo deste projeto foi realizar a caracterização genômica de duas pacientes e seus familiares portadores de rearranjo cromossômico estrutural envolvendo o braço curto do cromossomo 4 e o braço longo do cromossomo 12, associando técnicas de citogenética clássica (bandamento GTG), citogenética molecular (FISH) e citogenômica (array-CGH), para definição diagnóstica e maior conhecimento sobre os fatores envolvidos na correlação cariótipo-genótipo-fenótipo. Foram avaliados seis indivíduos, duas pacientes, primas em primeiro grau que apresentavam alterações fenotípicas, assim como seus familiares, portadores de translocação aparentemente equilibrada e fenótipo normal. Apesar das duas pacientes apresentarem alteração cromossômica comum, derivativo do cromossomo 4 [der(4)], foram observados achados fenotípicos distintos. A investigação permitiu a definição do diagnóstico de deleção 4p16 e trissomia 12qter para as duas pacientes com fenótipo alterado e cariótipo 46,XX,der(4)t(4;12)(p16;q24.3), a definição precisa dos pontos de quebra em 4p16.3 e 12q24.31->q24.33, assim como a determinação da origem parental do rearranjo e a definição do diagnóstico citogenético final de quatro portadores de translocação aparentemente equilibrada e cariótipo t(4;12)(4pter->4p16.3::2q24.31->12qter;12qter->12q24.31::4p16.3->4pter),direcionando o aconselhamento genético para a família. Nas duas pacientes, a técnica de array-CGH (Plataforma 2x400K, Agilent®) detectou uma diferença sutil de tamanho entre as perdas e ganhos referentes aos cromossomos envolvidos no rearranjo, sendo diagnosticado em P1 uma perda de 2.707.221 pb na citobanda 4p16.3, além de um ganho de 12.405.205 pb em 12q24.31->q24.33. A paciente 2 apresentou uma perda de 2.710.969 pb em 4p16.3 e um ganho de 12.393.885 pb em 12q24.31->q24.33. Ambas as regiões de desequilíbrio genômico incluem genes que podem ser relevantes para manifestação fenotípica observada nas pacientes, entre eles: WHSC1, NELFA, LETM1, FGFRL1 e SPON2. Os resultados da investigação citogenômica indicaram, ainda, a presença de translocação equilibrada nos quatro indivíduos portadores, não sendo detectadas perdas e/ou ganhos genômicos nas regiões dos pontos de quebra cromossômica. Os resultados obtidos na investigação do padrão de metilação dos genes FGFRL1 e SPON2 não permitiram afirmar que uma provável repressão da expressão gênica devido ao imprinting materno e paterno esteja associada às características fenotípicas distintas observadas nas duas pacientes. Embora tenha sido possível a indicação de genes correlacionados ao fenótipo das pacientes, a correlação entre a alteração genética e o fenótipo das mesmas pode depender da ação sinérgica dos mais de 190 genes envolvidos neste rearranjo cromossômico estrutural familiar. / Structural chromosomal rearrangements are potentially associated with the development of genetic disorders due to disruption, inactivation or gene dosage alterations. The objective of this project was to perform the genomic characterization of a familial structural chromosomal rearrangement involving the short arm of chromosome 4 and the long arm of chromosome 12 in two patients and carriers. The experimental approach involved using a combination of classical cytogenetic techniques (GTG banding), molecular cytogenetics (FISH) and cytogenomics (array-CGH), to provide a diagnostic definition and a better understanding of how changes in the karyotype and genotype may be associated with the phenotype. Six individuals were evaluated, two patients with phenotypic abnormalities, as well as the carriers of an apparently balanced 4p;12q translocation with normal phenotypes. Although the two patients showed a common chromosomal abnormality, the derivative chromosome 4 [der (4)], they presented distinct phenotypic findings. The investigation provided a definition of the diagnosis of 4p16 deletion and trisomy 12qter for the two patients with abnormal phenotypes and a karyotype 46,XX,der(4)t(4;12)(p16;q24.3). In addition a precise definition of the breakpoints at 4p16.3 and 12q24.31->q24.33, and the parental origin of the rearrangement was determined. A precise definition of the cytogenetic diagnosis of four carriers with an apparently balanced translocation and karyotype t(4;12)(4pter->4p16.3::2q24.31->12qter; 12qter 12q24.31->4pter::4p16.3), facilitated the genetic counseling for the family. In both patients, the array-CGH technique (2x400K Platform, Agilent®) detected a subtle difference in size between losses and gains in the chromosomal regions involved in the rearrangement. Patient 1 presented a loss of 2,707,221 bp in the cytoband 4p16.3, and a gain of 12,405,205 bp in 12q24.31->q24.33. Patient 2 had a loss of 2,710,969 bp in 4p16.3 and a gain of 12,393,885 bp in 12q24.31 -> q24.33. Both regions of genomic imbalance included genes that may be relevant to phenotypic findings observed in our patients, including: WHSC1, NELFA, LETM1, FGFRL1 and SPON2. Genomic findings also confirmed the presence of a balanced translocation in four carriers, with no genomic losses and/or gains in the regions of chromosome breakpoints. The results of the investigation of the methylation pattern of FGFRL1 and SPON2 genes could not demonstrate that repression of gene expression due to maternal and paternal imprinting was associated with the distinct phenotypes observed in the two patients. Although it has been possible to indicate genes related to the phenotype of the patients, the correlation between the genetic alteration and phenotype may depend on the synergistic action of multiple genes from more than the 190 involved in this familial chromosomal rearrangement.

Rearranjos cromossômicos estruturais estão potencialmente associados ao desenvolvimento de doenças genéticas devido à disrupção, inativação ou alteração da dosagem gênica. O objetivo deste projeto foi realizar a caracterização genômica de duas pacientes e seus familiares portadores de rearranjo cromossômico estrutural envolvendo o braço curto do cromossomo 4 e o braço longo do cromossomo 12, associando técnicas de citogenética clássica (bandamento GTG), citogenética molecular (FISH) e citogenômica (array-CGH), para definição diagnóstica e maior conhecimento sobre os fatores envolvidos na correlação cariótipo-genótipo-fenótipo. Foram avaliados seis indivíduos, duas pacientes, primas em primeiro grau que apresentavam alterações fenotípicas, assim como seus familiares, portadores de translocação aparentemente equilibrada e fenótipo normal. Apesar das duas pacientes apresentarem alteração cromossômica comum, derivativo do cromossomo 4 [der(4)], foram observados achados fenotípicos distintos. A investigação permitiu a definição do diagnóstico de deleção 4p16 e trissomia 12qter para as duas pacientes com fenótipo alterado e cariótipo 46,XX,der(4)t(4;12)(p16;q24.3), a definição precisa dos pontos de quebra em 4p16.3 e 12q24.31->q24.33, assim como a determinação da origem parental do rearranjo e a definição do diagnóstico citogenético final de quatro portadores de translocação aparentemente equilibrada e cariótipo t(4;12)(4pter->4p16.3::2q24.31->12qter;12qter->12q24.31::4p16.3->4pter),direcionando o aconselhamento genético para a família. Nas duas pacientes, a técnica de array-CGH (Plataforma 2x400K, Agilent®) detectou uma diferença sutil de tamanho entre as perdas e ganhos referentes aos cromossomos envolvidos no rearranjo, sendo diagnosticado em P1 uma perda de 2.707.221 pb na citobanda 4p16.3, além de um ganho de 12.405.205 pb em 12q24.31->q24.33. A paciente 2 apresentou uma perda de 2.710.969 pb em 4p16.3 e um ganho de 12.393.885 pb em 12q24.31->q24.33. Ambas as regiões de desequilíbrio genômico incluem genes que podem ser relevantes para manifestação fenotípica observada nas pacientes, entre eles: WHSC1, NELFA, LETM1, FGFRL1 e SPON2. Os resultados da investigação citogenômica indicaram, ainda, a presença de translocação equilibrada nos quatro indivíduos portadores, não sendo detectadas perdas e/ou ganhos genômicos nas regiões dos pontos de quebra cromossômica. Os resultados obtidos na investigação do padrão de metilação dos genes FGFRL1 e SPON2 não permitiram afirmar que uma provável repressão da expressão gênica devido ao imprinting materno e paterno esteja associada às características fenotípicas distintas observadas nas duas pacientes. Embora tenha sido possível a indicação de genes correlacionados ao fenótipo das pacientes, a correlação entre a alteração genética e o fenótipo das mesmas pode depender da ação sinérgica dos mais de 190 genes envolvidos neste rearranjo cromossômico estrutural familiar. / Structural chromosomal rearrangements are potentially associated with the development of genetic disorders due to disruption, inactivation or gene dosage alterations. The objective of this project was to perform the genomic characterization of a familial structural chromosomal rearrangement involving the short arm of chromosome 4 and the long arm of chromosome 12 in two patients and carriers. The experimental approach involved using a combination of classical cytogenetic techniques (GTG banding), molecular cytogenetics (FISH) and cytogenomics (array-CGH), to provide a diagnostic definition and a better understanding of how changes in the karyotype and genotype may be associated with the phenotype. Six individuals were evaluated, two patients with phenotypic abnormalities, as well as the carriers of an apparently balanced 4p;12q translocation with normal phenotypes. Although the two patients showed a common chromosomal abnormality, the derivative chromosome 4 [der (4)], they presented distinct phenotypic findings. The investigation provided a definition of the diagnosis of 4p16 deletion and trisomy 12qter for the two patients with abnormal phenotypes and a karyotype 46,XX,der(4)t(4;12)(p16;q24.3). In addition a precise definition of the breakpoints at 4p16.3 and 12q24.31->q24.33, and the parental origin of the rearrangement was determined. A precise definition of the cytogenetic diagnosis of four carriers with an apparently balanced translocation and karyotype t(4;12)(4pter->4p16.3::2q24.31->12qter; 12qter 12q24.31->4pter::4p16.3), facilitated the genetic counseling for the family. In both patients, the array-CGH technique (2x400K Platform, Agilent®) detected a subtle difference in size between losses and gains in the chromosomal regions involved in the rearrangement. Patient 1 presented a loss of 2,707,221 bp in the cytoband 4p16.3, and a gain of 12,405,205 bp in 12q24.31->q24.33. Patient 2 had a loss of 2,710,969 bp in 4p16.3 and a gain of 12,393,885 bp in 12q24.31 -> q24.33. Both regions of genomic imbalance included genes that may be relevant to phenotypic findings observed in our patients, including: WHSC1, NELFA, LETM1, FGFRL1 and SPON2. Genomic findings also confirmed the presence of a balanced translocation in four carriers, with no genomic losses and/or gains in the regions of chromosome breakpoints. The results of the investigation of the methylation pattern of FGFRL1 and SPON2 genes could not demonstrate that repression of gene expression due to maternal and paternal imprinting was associated with the distinct phenotypes observed in the two patients. Although it has been possible to indicate genes related to the phenotype of the patients, the correlation between the genetic alteration and phenotype may depend on the synergistic action of multiple genes from more than the 190 involved in this familial chromosomal rearrangement.