Tumors employ a variety of genetic resistance mechanisms to evade immune responses and immunotherapies such as PD-1 blockade. The pleiotropic cytokine interferon-gamma (IFNγ) is a potent immune effector and critical for patient response to PD-1 blockade, yet conventional systemic delivery is hindered by severe dose limiting toxicities. As such, the effects of exogenously introduced IFNγ either as monotherapy or in combination with PD-1 blockade in the context of different tumor genetic background remain poorly understood. Synthetic biology allows programming of microbes for tumor-specific delivery of therapeutic candidates that are otherwise not possible using conventional administration strategies. Herein, we engineered a strain of probiotic bacteria that home to tumors and locally release IFNγ. We validated the efficacy of our therapeutic strain, either as monotherapy or in combination with PD-1 blockade, in multiple murine tumor models. Within this dissertation, we demonstrate that a single intratumoral injection of these IFNγ-producing bacteria is sufficient to drive systemic tumor antigen–specific antitumor immunity, without observable toxicity. Although cancer cells employ various resistance mechanisms to evade immune responses, bacteria-derived IFNγ additionally overcomes primary resistance to PD-1 blockade via activation of cytotoxic CD4⁺Foxp3⁻ and CD8⁺ T cells. Moreover, by activating NK cells, bacteria-derived IFNγ also overcome acquired resistance mechanisms to PD-1 blockade, specifically loss of function mutations in IFNγ signaling and antigen presentation pathways. Collectively, this dissertation highlights the promise of combining IFNγ-producing bacteria with PD-1 blockade as a therapeutic strategy for overcoming immunotherapy-resistant, locally advanced, and metastatic disease.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Uppsala universitet, 2007. / Härtill 5 uppsatser.

A hepatite auto-imune (HAI) é uma doença inflamatória crônica do fígado, de etiologia desconhecida, que acomete preferencialmente mulheres, com destruição progressiva do parênquima hepático e que, sem tratamento imunossupressor, evolui freqüentemente para cirrose. É uma doença rara na infância, com menos de 10% dos pacientes com doença hepática crônica, porém de alta mortalidade. Caracteriza-se pela presença de hipergamaglobulinemia, auto-anticorpos não órgãos-específicos e infiltrado inflamatório portal linfoplasmocitário. Cerca da metade dos pacientes atendidos no Instituto da Criança, apresenta também níveis elevados de IgE, sem causas aparentes como parasitoses ou atopia. A suscetibilidade genética à doença está principalmente associada a genes que codificam as moléculas de histocompatibilidade (HLA). A presença do HLA-DR é importante, mas não suficiente para o desenvolvimento dessa doença rara, fazendo inclusive supor um forte componente externo/ambiental no desencadeamento da doença. Genes recém descritos, localizados na região de classe III do Complexo Principal de Histocompatibilidade (CPH) e ligados ao controle da resposta imune, em especial, alguns próximos à junção com a região de classe I, têm sido investigados como \"loci\" secundários para o desenvolvimento de doenças auto-imunes. A forte associação da HAI com genes na região do MHC, bastante comuns na população, aliada a incidência muito baixa da doença, leva à questão da presença de genes adicionais de suscetibilidade, que, junto com o HLA-DR, seriam responsáveis pela suscetibilidade genética observada. Dessa forma, o HLADRB1* 13, além de um fator por si, também pode ser um marcador da região cromossômica, ou seja, de um haplótipo específico e que, portanto, carrega mais de um gene de suscetibilidade. Estudamos polimorfismos, tipo SNP, de xx genes próximos ao HLA-DRB1, como TNFA, LTA, NFKBIL1 e BAT1, buscando haplótipos de susceptibilidade à doença, em pacientes HAI-1 (n=105) e controles sadios (n=227). O haplótipo ancestral 8.1 que inclui HLA-DRB1*03 e o alelo raro na posição -308 do gene TNFA estava aumentado (p=0.0005). Já o alelo HLA-DRB1*13, presente na maioria dos pacientes, não mostrou haplótipo específico associado. Também avaliamos genes de citocinas envolvidas na produção de IgE, elevado em parte dos pacientes HAI-1. Na comparação com controles, a freqüência dos SNPs IL- 4+33 e IL13+110, localizados em genes vizinhos, apresentou aumento estatisticamente significante nos pacientes, sugerindo haver um grupo gênico adicional no cromossomo 5q31 envolvido na susceptibilidade à HAI / Autoimmune hepatitis (AIH) is an inflammatory chronic liver disease of unknown etiology found predominantly in females, leading when untreated, to cirrhosis. It is a rare disease in the childhood, corresponding to about 10% of patients with chronic hepatitis, but exhibits high mortality. It is characterized by hipergammaglobulinemia, organ nonspecific circulating autoantibodies, and an inflammatory liver-infiltrating lymphocytes and plasma cells. Almost half of patients investigated at Instituto da Criança had increased plasma IgE levels, without any apparent cause such as parasite infestation or atopy. Genetic predisposition to AIH has been mainly linked to genes coding for HLA class II molecules. HLA-DR is important but not sufficient to explain this rare disease, suggesting there is an external/environmental component triggering the disease. Recently, several genes in the class III region of MHC, linked to immune responses, especially near the junction with the MHC class I region have been investigated as secondary loci for autoimmune disease susceptibility. The strong association of AIH with genes in the MHC region, common in the population, but a disease with the very low incidence, suggests additional genes linked with HLA-DR could add to the disease susceptibility. So, HLA-DR*13 besides being a factor by itself, could also be a chromosomal region marker, taking part of a specific haplotype carrying more than one susceptibility gene. We studied single nucleotide polymorphisms (SNP) in genes near HLA-DRB1, like TNFA, LTA, NFKBIL1 and BAT1 searching for disease susceptibility haplotypes, in HAI-1 patients (n=105) compared to healthy controls (n=227). The ancestral haplotype 8.1, which includes HLA-DRB1*03 and the rare TNFA allele at position -308 was increased (p=0.0005). However, HLA-DRB1*13, though present in the majority of the patients, did not show any specific haplotype associated to it. xxii We also analyzed cytokine genes involved in IgE production, which is increased in a part of the AIH type 1 patients. In comparison with controls, the frequency of the SNPs IL-4+33 and IL13+110 was significantly increased, suggesting the existence of an additional gene cluster in chromosome 5q31 involved in the susceptibility to AIH

A hepatite auto-imune (HAI) é uma doença inflamatória crônica do fígado, de etiologia desconhecida, que acomete preferencialmente mulheres, com destruição progressiva do parênquima hepático e que, sem tratamento imunossupressor, evolui freqüentemente para cirrose. É uma doença rara na infância, com menos de 10% dos pacientes com doença hepática crônica, porém de alta mortalidade. Caracteriza-se pela presença de hipergamaglobulinemia, auto-anticorpos não órgãos-específicos e infiltrado inflamatório portal linfoplasmocitário. Cerca da metade dos pacientes atendidos no Instituto da Criança, apresenta também níveis elevados de IgE, sem causas aparentes como parasitoses ou atopia. A suscetibilidade genética à doença está principalmente associada a genes que codificam as moléculas de histocompatibilidade (HLA). A presença do HLA-DR é importante, mas não suficiente para o desenvolvimento dessa doença rara, fazendo inclusive supor um forte componente externo/ambiental no desencadeamento da doença. Genes recém descritos, localizados na região de classe III do Complexo Principal de Histocompatibilidade (CPH) e ligados ao controle da resposta imune, em especial, alguns próximos à junção com a região de classe I, têm sido investigados como \"loci\" secundários para o desenvolvimento de doenças auto-imunes. A forte associação da HAI com genes na região do MHC, bastante comuns na população, aliada a incidência muito baixa da doença, leva à questão da presença de genes adicionais de suscetibilidade, que, junto com o HLA-DR, seriam responsáveis pela suscetibilidade genética observada. Dessa forma, o HLADRB1* 13, além de um fator por si, também pode ser um marcador da região cromossômica, ou seja, de um haplótipo específico e que, portanto, carrega mais de um gene de suscetibilidade. Estudamos polimorfismos, tipo SNP, de xx genes próximos ao HLA-DRB1, como TNFA, LTA, NFKBIL1 e BAT1, buscando haplótipos de susceptibilidade à doença, em pacientes HAI-1 (n=105) e controles sadios (n=227). O haplótipo ancestral 8.1 que inclui HLA-DRB1*03 e o alelo raro na posição -308 do gene TNFA estava aumentado (p=0.0005). Já o alelo HLA-DRB1*13, presente na maioria dos pacientes, não mostrou haplótipo específico associado. Também avaliamos genes de citocinas envolvidas na produção de IgE, elevado em parte dos pacientes HAI-1. Na comparação com controles, a freqüência dos SNPs IL- 4+33 e IL13+110, localizados em genes vizinhos, apresentou aumento estatisticamente significante nos pacientes, sugerindo haver um grupo gênico adicional no cromossomo 5q31 envolvido na susceptibilidade à HAI / Autoimmune hepatitis (AIH) is an inflammatory chronic liver disease of unknown etiology found predominantly in females, leading when untreated, to cirrhosis. It is a rare disease in the childhood, corresponding to about 10% of patients with chronic hepatitis, but exhibits high mortality. It is characterized by hipergammaglobulinemia, organ nonspecific circulating autoantibodies, and an inflammatory liver-infiltrating lymphocytes and plasma cells. Almost half of patients investigated at Instituto da Criança had increased plasma IgE levels, without any apparent cause such as parasite infestation or atopy. Genetic predisposition to AIH has been mainly linked to genes coding for HLA class II molecules. HLA-DR is important but not sufficient to explain this rare disease, suggesting there is an external/environmental component triggering the disease. Recently, several genes in the class III region of MHC, linked to immune responses, especially near the junction with the MHC class I region have been investigated as secondary loci for autoimmune disease susceptibility. The strong association of AIH with genes in the MHC region, common in the population, but a disease with the very low incidence, suggests additional genes linked with HLA-DR could add to the disease susceptibility. So, HLA-DR*13 besides being a factor by itself, could also be a chromosomal region marker, taking part of a specific haplotype carrying more than one susceptibility gene. We studied single nucleotide polymorphisms (SNP) in genes near HLA-DRB1, like TNFA, LTA, NFKBIL1 and BAT1 searching for disease susceptibility haplotypes, in HAI-1 patients (n=105) compared to healthy controls (n=227). The ancestral haplotype 8.1, which includes HLA-DRB1*03 and the rare TNFA allele at position -308 was increased (p=0.0005). However, HLA-DRB1*13, though present in the majority of the patients, did not show any specific haplotype associated to it. xxii We also analyzed cytokine genes involved in IgE production, which is increased in a part of the AIH type 1 patients. In comparison with controls, the frequency of the SNPs IL-4+33 and IL13+110 was significantly increased, suggesting the existence of an additional gene cluster in chromosome 5q31 involved in the susceptibility to AIH

A doença do enxerto versus hospedeiro (DEVH) é uma grave complicação do transplante de órgãos sólidos, com alta mortalidade. Seu estudo tem sido limitado pela carência de modelos experimentais apropriados. Descreve-se um modelo de DEVH baseado no aumento do quimerismo, sua evolução clínica, histopatológica, do número das células quiméricas, do perfil das citocinas e da tolerância imunológica. Ratos Lewis (LEW) foram submetidos a transplante simultâneo de intestino delgado e medula óssea provenientes de ratos ACI (grupo de estudo - E) ou LEW (grupo controle - C), tratados com FK-506 (1 mg/Kg/dia) entre o 0 e 13o PO, e uma dose semanal daí por diante. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos: E1- 6 ratos sacrificados no 120o PO. E2- 8 ratos após apresentarem sinais clínicos graves de DEVH entre o 189o e o 271o PO. Como controle, ratos LEW foram receptores dos mesmos tipos de enxertos provenientes de ratos LEW, submetidos à mesma imunossupressão e foram assim divididos: C1- 6 ratos sacrificados no 120o PO, C2- 5 ratos sacrificados entre o 223o e o 270o PO. A citometria de fluxo foi realizada para quantificar a porcentagem das células linfóides de ACI doadores no sangue periférico nos E1, E2 em 6 períodos: 30o PO, 65o PO, 95o PO, 120o PO, 160o PO, 200o PO. Os animais foram examinados 2 vezes por semana à procura de sinais de DEVH (rash cutâneo, perda de peso, de pelo e hiperqueratose). No sacrifício dos animais do grupo E1 e C1, foram colhidas amostras de língua (LI), de linfonodos cervicais (LC), intestino delgado do receptor e do enxerto para análise das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa por meio da reação em cadeia da polimerase. Em todos os grupos foram também colhidas amostras destes órgãos para histopatologia e nos animais do grupo E2 linfonodos cervicais foram processados para análise da reatividade celular por meio da reação mista dos linfócitos (MLR). A evolução clínica e histopatológica foi graduada de 0 a 3 de acordo com a severidade dos sintomas e do infiltrado mononuclear das amostras. Os ratos dos grupos E1 e E2 iniciaram sinais da DEVH entre o 84o e 115o PO. Os ratos dos grupos C1 e C2 não apresentaram evidência de DEVH. Amostras de LI e LC dos ratos do grupo E1 apresentaram alterações histopatológicas grau 2 e do grupo E2 apresentaram alterações histopatológicas grau 3, respectivamente. Nenhuma alteração histopatológica foi encontrada nos ratos do grupo controle e em amostras do ID. Nenhuma alteração histopatológica foi encontrada no intestino delgado do receptor e do enxerto. O aumento da porcentagem de células do doador no sangue periférico do receptor foi progressivo chegando a 5,4±2.3% no 10o período, 21±4,6% no 3o período e 39,3±4% no 6o período. IL-2, IL-6, IL-10, IFN-gma e TNF-alfa estiveram aumentados em língua e IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa em linfonodos cervicais. Os linfócitos de ratos do grupo E2 mostraram hiporreatividade aos de ratos ACI e hiperreatividade aos de ratos PVG (terceira parte) denotando tolerância imunológica. Neste modelo experimental há uma inexorável evolução imunológica para DEVH; existe correlação direta entre o aumento do quimerismo em sangue periférico e da expressão de citocinas em língua e linfonodos cervicais e a severidade da DEVH, além da indução de tolerância imunológica do rato do grupo E2 quimérico ao rato ACI normal. / Graft-versus-host disease (GVHD) has been a major concern after small bowel transplantation (SBTX) and the lack of suitable experimental models has limited the study of GVHD after solid organ transplantation. Here we describe a re1evant experimental model of GVHD after fully allogeneic SBTX based on chimerism augmentation, its clinical and histophatological evolution, cytokine involvement, responsible donor cell and immunologic tolerance analysis. LEW rat recipients received orthotopic SBTX and simultaneous donor bone marrow cell infusion (250x106), from ACI rats (experimental group - E) or LEW (control group C). FK-506 was administered dayly at a dose of 1 mg/kg on day 0 to 13, then continued as a weekly injection of same dose until the experimental end point. The recipients were divided in the following groups: E1 - 6 rats sacrificed at 120° POD. E2 - 8 rats sacrificed with critical GVHD between DPO 189 to 271. LEW recipient of LEW grafts, under the same immunossupression were used as control and divided as: C1 - 6 rats sacrificed at POD 120; C2- 5 rats sacrificed between 223 and 270 POD the number of donor cell in the recipient circulation was determined by flowcytometry in 6 pos-operative time: 30, 65, 95, 120, 160, 200. The rats were analyzed twice a week for body weigh and searching for signs of GVHD (cutaneous rush, hiperkeratosis and loss of hair and body weigh). At the sacrificed, samples from tongue (TG), cervical lymph node (CLN), donor (SBD) and recipient (SBR) small bowel were taken from all animals for histophatology and from E1 and C1l animals for IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa cytokines analysis using reverse transcription polymerase chain reaction. Samples from cervical lynph nodes of 5 animals from group E2 were used for mixed lymphocyte reaction for tolerance analysis. The clinical and histophatological evolution of the disease were evaluated from degree 0 to 3 according to the severity. GVHD in E1 and E2 animals started between 84 and 115 POD. Histophatological analysis of TG and CLN showed that E1 animals present GVHD grade 2 and E2 animals grade 3. The increase of donors cells in the recipient circulation was progressive and account for 5.4± 2.3% at POD 30, 21.4±4.6% at POD 95 and 39.3±4% at POD 200. IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa were upregulated in CLN and IL-2, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa were upregulated in TG when compared with the respective controls. The lymphocytes from E2 group showed hyporeactivety to lymphocytes of normal ACI and hypereactivety to those of PVG, meaning tolerance. No cytokines alteration was noted in SBD neither SBR. Animals from group C1 and C2 did not present any sign of disease. This result show that GVHD is a inexoravel evolution under the experimental conditions of this study and the evolution of the disease is near correlated with the augmentation of the donor cells in the recipient circulation and upregulation of cytokines gene expression in target organs. Tolerance to the same donor strain lynphocytes was also noted.

A doença do enxerto versus hospedeiro (DEVH) é uma grave complicação do transplante de órgãos sólidos, com alta mortalidade. Seu estudo tem sido limitado pela carência de modelos experimentais apropriados. Descreve-se um modelo de DEVH baseado no aumento do quimerismo, sua evolução clínica, histopatológica, do número das células quiméricas, do perfil das citocinas e da tolerância imunológica. Ratos Lewis (LEW) foram submetidos a transplante simultâneo de intestino delgado e medula óssea provenientes de ratos ACI (grupo de estudo - E) ou LEW (grupo controle - C), tratados com FK-506 (1 mg/Kg/dia) entre o 0 e 13o PO, e uma dose semanal daí por diante. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos: E1- 6 ratos sacrificados no 120o PO. E2- 8 ratos após apresentarem sinais clínicos graves de DEVH entre o 189o e o 271o PO. Como controle, ratos LEW foram receptores dos mesmos tipos de enxertos provenientes de ratos LEW, submetidos à mesma imunossupressão e foram assim divididos: C1- 6 ratos sacrificados no 120o PO, C2- 5 ratos sacrificados entre o 223o e o 270o PO. A citometria de fluxo foi realizada para quantificar a porcentagem das células linfóides de ACI doadores no sangue periférico nos E1, E2 em 6 períodos: 30o PO, 65o PO, 95o PO, 120o PO, 160o PO, 200o PO. Os animais foram examinados 2 vezes por semana à procura de sinais de DEVH (rash cutâneo, perda de peso, de pelo e hiperqueratose). No sacrifício dos animais do grupo E1 e C1, foram colhidas amostras de língua (LI), de linfonodos cervicais (LC), intestino delgado do receptor e do enxerto para análise das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa por meio da reação em cadeia da polimerase. Em todos os grupos foram também colhidas amostras destes órgãos para histopatologia e nos animais do grupo E2 linfonodos cervicais foram processados para análise da reatividade celular por meio da reação mista dos linfócitos (MLR). A evolução clínica e histopatológica foi graduada de 0 a 3 de acordo com a severidade dos sintomas e do infiltrado mononuclear das amostras. Os ratos dos grupos E1 e E2 iniciaram sinais da DEVH entre o 84o e 115o PO. Os ratos dos grupos C1 e C2 não apresentaram evidência de DEVH. Amostras de LI e LC dos ratos do grupo E1 apresentaram alterações histopatológicas grau 2 e do grupo E2 apresentaram alterações histopatológicas grau 3, respectivamente. Nenhuma alteração histopatológica foi encontrada nos ratos do grupo controle e em amostras do ID. Nenhuma alteração histopatológica foi encontrada no intestino delgado do receptor e do enxerto. O aumento da porcentagem de células do doador no sangue periférico do receptor foi progressivo chegando a 5,4±2.3% no 10o período, 21±4,6% no 3o período e 39,3±4% no 6o período. IL-2, IL-6, IL-10, IFN-gma e TNF-alfa estiveram aumentados em língua e IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa em linfonodos cervicais. Os linfócitos de ratos do grupo E2 mostraram hiporreatividade aos de ratos ACI e hiperreatividade aos de ratos PVG (terceira parte) denotando tolerância imunológica. Neste modelo experimental há uma inexorável evolução imunológica para DEVH; existe correlação direta entre o aumento do quimerismo em sangue periférico e da expressão de citocinas em língua e linfonodos cervicais e a severidade da DEVH, além da indução de tolerância imunológica do rato do grupo E2 quimérico ao rato ACI normal. / Graft-versus-host disease (GVHD) has been a major concern after small bowel transplantation (SBTX) and the lack of suitable experimental models has limited the study of GVHD after solid organ transplantation. Here we describe a re1evant experimental model of GVHD after fully allogeneic SBTX based on chimerism augmentation, its clinical and histophatological evolution, cytokine involvement, responsible donor cell and immunologic tolerance analysis. LEW rat recipients received orthotopic SBTX and simultaneous donor bone marrow cell infusion (250x106), from ACI rats (experimental group - E) or LEW (control group C). FK-506 was administered dayly at a dose of 1 mg/kg on day 0 to 13, then continued as a weekly injection of same dose until the experimental end point. The recipients were divided in the following groups: E1 - 6 rats sacrificed at 120° POD. E2 - 8 rats sacrificed with critical GVHD between DPO 189 to 271. LEW recipient of LEW grafts, under the same immunossupression were used as control and divided as: C1 - 6 rats sacrificed at POD 120; C2- 5 rats sacrificed between 223 and 270 POD the number of donor cell in the recipient circulation was determined by flowcytometry in 6 pos-operative time: 30, 65, 95, 120, 160, 200. The rats were analyzed twice a week for body weigh and searching for signs of GVHD (cutaneous rush, hiperkeratosis and loss of hair and body weigh). At the sacrificed, samples from tongue (TG), cervical lymph node (CLN), donor (SBD) and recipient (SBR) small bowel were taken from all animals for histophatology and from E1 and C1l animals for IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa cytokines analysis using reverse transcription polymerase chain reaction. Samples from cervical lynph nodes of 5 animals from group E2 were used for mixed lymphocyte reaction for tolerance analysis. The clinical and histophatological evolution of the disease were evaluated from degree 0 to 3 according to the severity. GVHD in E1 and E2 animals started between 84 and 115 POD. Histophatological analysis of TG and CLN showed that E1 animals present GVHD grade 2 and E2 animals grade 3. The increase of donors cells in the recipient circulation was progressive and account for 5.4± 2.3% at POD 30, 21.4±4.6% at POD 95 and 39.3±4% at POD 200. IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa were upregulated in CLN and IL-2, IL-6, IL-10, IFN-gama e TNF-alfa were upregulated in TG when compared with the respective controls. The lymphocytes from E2 group showed hyporeactivety to lymphocytes of normal ACI and hypereactivety to those of PVG, meaning tolerance. No cytokines alteration was noted in SBD neither SBR. Animals from group C1 and C2 did not present any sign of disease. This result show that GVHD is a inexoravel evolution under the experimental conditions of this study and the evolution of the disease is near correlated with the augmentation of the donor cells in the recipient circulation and upregulation of cytokines gene expression in target organs. Tolerance to the same donor strain lynphocytes was also noted.