Pyrrolizidinalkaloide sind eine Gruppe von sekundären Pflanzenstoffen, welche durch ihre Genotoxizität und Kanzerogenität schon lange in der Kritik des Bundesinstituts für Risikobewertung (BfR) stehen. In der Leber werden diese Stoffe metabolisiert und in ihre aktive Form überführt. Als Folge eines übermäßigen Konsums von Pyrrolizidinalkaloiden wurden Fälle der venösen okklusiven Lebererkrankungen beobachtet und auch die Entstehung von Tumoren in Tiermodellen konnte auf eine Pyrrolizidinalkaloidexposition zurückgeführt werden. Die vorliegende Arbeit verglich das genotoxische Potenzial der drei Pyrrolizidinalkaloide Lasiocarpin, Seneciphyllin und Europin in den humanen Leberzelllinien HepG2 und Huh6. Die Einschätzung erfolgte anhand der Ergebnisse der durchgeführten Mikrokerntests. Des Weiteren wurde die Rolle des metabolischen Enzyms CYP-3A4, durch Zugabe entsprechender Inhibitoren und Stimulatoren, sowie die Wirkung des intrazellulären Glutathions auf die Toxizität der Pyrrolizidinalkaloide untersucht. Zudem wurde ein Schwerpunkt auf die Analyse der Mitose von mit Pyrrolizidinalkaloiden behandelten Zellen gelegt. Hier lag die Konzentration auf der Formatierung der Mikrotubuli und auf der Entstehung der Mikrokerne. Eine abschließende Lebendzellmikroskopie visualisierte den toxischen Einfluss des Pyrrolizidinalkaloides Lasiocarpin auf die Mitose und Kernteilung der HepG2-Zellen und erlaubt einen Ausblick auf weitere Forschungshypothesen. Das toxische Potenzial der drei untersuchten Pyrrolizidinalkaloide zeigte gleiche Tendenzen in den untersuchten toxischen Merkmalen. Bei allen verwendeten Substanzen konnte ein Anstieg der Mikrokernzahl und der apoptotischen Zellen beobachtet werden. Gegenläufig dazu zeigte sich bei allen drei Pyrrolizidinalkaloiden eine Reduktion der Mitoserate und auch ein Rückgang des Proliferationsindex. Lasiocarpin zeigte eindeutig das höchste genotoxische Potenzial. Die Rolle des Metabolisierungsenzyms Cytochrom P450 auf den Stoffwechsel konnte anhand von klaren Ergebnissen definiert werden. Nach Hemmung des CYP-3A4-Enzyms durch das Antibiotikum Ketoconazol wurden weniger Mikrokerne durch das Pyrrolizidinalkaloid gebildet und die Zellproliferation stieg an. Die Behandlung mit Rifampicin, das eine Induktion der CYP-3A4-Expression verursachen kann, führte zu einer signifikant höheren Mikrokernzahl und einer Reduktion des Proliferationsindex im Beisein von Lasiocarpin. Die Auswirkung einer Glutathiondepletion auf die Zyto- und Genotoxizität von Lasiocarpin wurde in dieser Studie ebenfalls untersucht. Zum einen wird klar, dass Glutathion eine Rolle in der Zytotoxizität der Pyrrolizidinalkaloiden spielt. Nach Behandlung von Gluatathion-depletierten Zellen mit Lasiocarpin sank der Proliferationsindex im Vergleich zu den Zellen, welche lediglich mit Lasiocarpin behandelt wurden. Aber auch die genotoxische Wirkung des Lasiocarpins kann durch Depletion des Glutathions verstärkt werden, was die signifikante Erhöhung der Mikrokernrate in den Huh6-Zellen belegt. Ein großer Teil dieser Forschungsarbeit behandelt den Einfluss von Pyrrolizidinalkaloiden auf die Zellteilung. So wurde einerseits die Veränderung der Anteile der mitotischen Stadien beurteilt und die Entwicklung von mitotischen Störungen quantifiziert. Alle durchgeführten Versuche zeigten, dass die Zahl der mitotischen Zellen konzentrationsabhängig durch Lasiocarpin gesenkt wird. In der Analyse der prozentualen Verteilung der mitotischen Stadien fiel auf, dass sich durch Lasiocarpin vor allem der Anteil der Zellen in der Pro- und Metaphase verringerte. Besonders deutlich zeigte sich zudem dosisabhängig die stärkere Formatierung von fehlerhaften mitotischen Figuren. Durch die durchgeführte Kinetochor-Antikörperfärbung konnte aufgezeigt werden, dass die Mikrokerne chromosomale DNA enthalten und vermutlich durch den Verlust von vollständigen Chromosomen entstehen. Die bereits beschriebene Zunahme an gestörten mitotischen Figuren wurde ebenfalls durch die alpha-Tubulin-Antikörperfärbung bestätigt. Diese Untersuchung richtete den Fokus auf die Ausbildung der Mikrotubuli während der Mitose und den genotoxischen Einfluss des Pyrrolizidinalkaloids Lasiocarpin darauf. Durch Lasiocarpin entstanden signifikant mehr Zellen mit multiplen Spindelpolen und gleichzeitig nahm der Anteil an korrekt ausgebildeten Spindeln ab. Durch den toxischen Einfluss von Lasiocarpin bildeten sich zudem häufiger Zellen ohne erkennbaren Spindelpol mit einer deutlich gestörten Spindelorganisation. In der abschließend durchgeführten Lebendzellmikroskopie konnten die gewonnenen Ergebnisse über die genotoxische und zytotoxische Wirkung von Lasiocarpin auf die Leberzellen bestätigt und visualisiert werden. Eine neue Erkenntnis durch die Lebendzellmikroskopie ist die Zunahme der Dauer der Mitose durch Lasiocarpin. Diese Verlängerung der Zellteilung kann möglicherweise durch einen mitotischen Arrest, welcher durch Aktivierung eines Checkpoint-Signalwegs ausgelöst wird, erklärt werden. Daher sollte zukünftig die Auswirkung von Pyrrolizidinalkaloiden auf die verschiedenen Kontrollpunkte der Zellteilung untersucht werden, um die Toxizität der Pyrrolizidinalkaloide besser beurteilen zu können. / Pyrrolizidine alkaloids are a group of secondary plant substances that have long been discussed by the German Federal Institute for Risk Assessment (BfR) for their genotoxicity and carcinogenicity. In the liver, these substances are metabolized and converted into their active form. As a consequence of excessive consumption of pyrrolizidine alkaloids, cases of venous occlusive liver disease have been observed and the development of tumours in rodent models could also be attributed to pyrrolizidine alkaloid exposure. The present study compared the genotoxic potential of the three pyrrolizidine alkaloids lasiocarpine, seneciphylline and europine on the liver cell lines HepG2 and Huh6. The assessment was based on the results of the cytokinesis block micronucleus test. Furthermore, the role of the metabolic enzyme CYP-3A4, through the addition of appropriate inhibitors and stimulators, as well as the effect of intracellular glutathione on the toxicity of the pyrrolizidine alkaloids was investigated. In addition, emphasis was placed on the analysis of mitosis of cells treated with pyrrolizidine alkaloids. Here, the focus was on the formation of microtubules OR spindel distrubing effects of pyrrolizidine alkaloids and the formation of micronuclei. Finally live cell imaging was used to visualize the toxic influence of the pyrrolizidine alkaloid lasiocarpine on the cell division of HepG2 cells and allowed us to have a closer look to our research hypotheses on the mitotic distrubances as a further mode of action of pyrrolizidine alkaloids. The toxic potential of the three pyrrolizidine alkaloids investigated differed significantly. An increase in the number of micronuclei and apoptotic cells was observed for all substances used. In contrast, all three pyrrolizidine alkaloids showed a reduction in the mitotic rate and also a decrease in the proliferation index. Lasiocarpine clearly showed the highest genotoxic potential. Regarding metabolization of pyrrolizidine alkaloids, after inhibition of the CYP-3A4 enzyme, by the antibiotic ketoconazole, fewer micronuclei were induced by the pyrrolizidine alkaloid and cell proliferation increased. In turn, induction of CYP-3A4 expression, by rifampicin triggered, led to a significantly higher micronucleus number and a reduction in the proliferation index in the presence of the pyrrolizidine alkaloid lasiocarpine. The effect of glutathione depletion on the cyto- and genotoxicity of lasiocarpine was also investigated in this study. First, there are hints that glutathione plays a role in the cytotoxicity of pyrrolizidine alkaloids. After treatment of glutathione-depleted cells with lasiocarpine, the proliferation index decreased compared to the cell group treated with lasiocarpine alone. However, the genotoxic effect of lasiocarpine was also enhanced by depletion of glutathione, as evidenced by the significant increase in micronucleus rate. A large part of this research deals with the influence of pyrrolizidine alkaloids on cell division. Thus, on the one hand, the change in the proportions of mitotic stages was assessed and the development of mitotic disorders quantified. All experiments carried out showed that the number of mitotic cells was reduced by lasiocarpine in a concentration-dependent manner. In the analysis of the percentage distribution of the mitotic stages, it was noticeable that lasiocarpine mainly reduced the proportion of cells in prophase and metaphase. In addition, the stronger formatting of defective mitotic figures was particularly evident in a dose-dependent manner. The kinetochore antibody staining carried out revealed that the micronuclei presumably resulted from the loss of complete chromosomes. The previously described increase in disrupted mitotic figures was also confirmed by alpha-tubulin antibody staining. This study focused on the formation of microtubules during mitosis and the genotoxic influence of the pyrrolizidine alkaloid lasiocarpine on it. Lasiocarpine produced significantly more cells with multiple spindle poles and at the same time the proportion of correctly formed spindles decreased. Due to the toxic influence of lasiocarpine, cells without a recognizable spindle pole with a clearly disturbed spindle organisation were also formed more frequently. In the final live cell microscopy, the results obtained on the genotoxic and cytotoxic effect of lasiocarpine on liver cells could be confirmed and visualized. A new finding through cell imaging is the increase in the duration of mitosis by lasiocarpine. This prolongation of mitosis and formation of daughter nuclei can possibly be explained by a mitotic arrest triggered by activation of a checkpoint signalling pathway. Therefore, the effect of pyrrolizidine alkaloids on the different checkpoints of cell division should be investigated in the future in order to better assess the toxicity of the pyrrolizidine alkaloids.

Im Fokus dieser Studien standen mit Indicaxanthin und Betanin die beiden wichtigsten Vertreter der Betalaine sowie Kaktusfeigen- (Opuntia ficus indica) Extrakt. Die Durchführung der Studien erfolgte in folgenden Schritten: - Isolierung der Referenzsubstanzen Betanin und Indicaxanthin sowie Herstellung von Kaktusfeigen-Extrakt und daraus gewonnener Fraktionen, - Untersuchung der Cytotoxizität von Betanin, Indicaxanthin und Kaktusfeigen-Extrakt in humanen permanent Zell-Linien, - Beeinflussung der Apoptose und des Zellzyklus durch Betanin, Indicaxanthin und Kaktusfeigen-Extrakt in humanen permanent Zell-Linien, - Beeinflussung von Enzymen des Fremdstoffmetabolismus durch Betanin, Indica-xanthin und Kaktusfeigen-Extrakt in humanen permanent Zell-Linien. Die Gewinnung von Indicaxanthin (aus Kaktusfeigen), Betanin (aus Rote Beete-Konzentrat) sowie Kaktusfeigen-Extrakt erfolgte anhand literaturbekannter Methoden. Zur Bestimung der Cytotoxizität wurde untersucht, ob die Testsubstanzen die Proliferation von Caco2-, HT29- und HepG2-Zellen hemmen können. Als Ergebnis wurden EC50-Werte für die antiproliferative Wirkung von Betanin in Caco2-Zellen sowie für Kaktusfeigen-Extrakt in Caco2-, HT29- und HepG2-Zellen gefunden. Ein Einfluss der Testsubstanzen auf den Zellzyklus von Caco2- und HT29-Zellen wurde nicht beobachtet. Weiterhin induzierten die Testsubstanzen keine Apoptose in Caco2- oder HT29-Zellen. In den Studien zum Fremdstoffmetabolismus wurde beobachtet, dass vor allem Kaktusfeigen-Extrakt den Substratumsatz von Phase II-Enzyme wie UDP-Glucuronosyltransferase und Glutathion-S-Transferase steigern kann. / For bioactivity studies of betalain colorants and prickly pear extracts the most important members of the betalain family, i.e. betanine and indicaxanthine, were in the center of interest. The studies were conducted as follows: - Isolation of the reference substances betanine and indicaxanthine as well as the preparation of the prickly pear extract and fractions herefrom, - study of the cytotoxicity of betanine, indicaxanthine and prickly pear extract in human permanent cell cultures, - study of the influence of betanine, indicaxanthine and prickly pear extract on apoptosis and cell cycle in human permanent cell cultures, - study of the influence of betanine, indicaxanthine and prickly pear extract on enzymes of the xenobiotic metabolism in human permanent cell cultures. The preparation of indicaxanthine (from prickly pear fruits), betanine (from red beet concentrate) and prickly pear extract was carried out on the basis of published methods. To evaluate the cytotoxicity was examined, wether the testcompounds are able to inhibit the proliferation of Caco2-, HT29- and HepG2-Cells. As result EC50-values for the antiproliferative effect of betanine in Caco2-cells as well as for prickly pear extract in Caco2-, HT29- and HepG2-cells have been measured. An influence of the testcompounds on the cell cycle of Caco2- and HT29-cells was not observed. Further the testcompounds were not able to induce apoptosis in Caco2- and HT29-cells. In the studies with xenobiotic metabolising enzymes was observed, that especially prickly pear extract was able increase the substrate transformation of the phase II-enzymes UDP-Glucuronosyltransferase and Glutathione-S-Transferase.

While numerous experiments on NFAT were already performed with CD4+ T cells showing defective cytokine release and a reduced T helper cell development, no detailed studies existed for CD8+ T cells. From this point, we wanted to examine the impact of NFATc1 and c2 on the physiological functions of CD8+ T cells in vitro and in vivo. Therefore, we used a murine infection model with the bacteria Listeria monocytogenes and mice in which NFATc1 was specifically depleted in the T cell compartment. Our first in vitro studies showed a typical NFATc1 and c2 nuclear translocation and changes on mRNA levels upon T cell activation similarly in CD4+ as well as in CD8+ T cells extracted from wild type mice. NFAT nuclear translocation is important for target gene activation and generation of effector functions. Stimulated T cell populations lacking NFATc1 and/or NFATc2 showed a markedly decreased expression of Th1/Tc1 cytokines, as e.g. IL 2 and IFNγ being important for the clearance of intracellular pathogens. From our in vitro model for the generation of allogenically reactive cytotoxic CD8+ T cells, we revealed a decreased killing and lytic granule-release capacity in Nfatc1 inactivated CD8+ T cells whereas NFATc2-/- cytotoxic T cells did not show an altered cytotoxic response compared to wild type cells. Interestingly, we found lytic granules accumulated and mitochondria not getting translocated to the immunological synapse upon re-stimulation in NFATc1-deficient CD8+ T cells. Together with results showing the CsA insensitivity of the CTL killing/degranulation capacities, we assume that some major cellular processes are affected by NFATc1 which are not directly linked to the TCR-induced signal transduction cascade. We also showed the importance of NFATc1 in T cells during intracellular infections with the bacteria Listeria monocytogenes in an in vivo mouse model. After five days, only few bacteria were detected in wt mice whereas high amounts of Listeria particles were extracted from livers of Nfatc1fl/fl x Cd4 cre mice. Although the reactivity towards the pathogen was similar in both groups, a decreased cytokine expression in NFATc1-/- CD8+ T cells was observed together with an altered memory cell generation. Our results show the importance of NFATc1 in CD8+ T cells and give some clue for a possible connection to other basal cellular functions, as e.g. the formation of an immunological synapse. / Viele Experimente zur Rolle von NFAT wurden bereits anhand von CD4+ T Zellen durchgeführt und zeigten eine veränderte Zellphysiologie. Hingegen wurden CD8+ T Zellen diesbezüglich noch nicht intensiv studiert. Deshalb untersuchten wir den Einfluss von NFATc1 und NFATc2 auf die Funktion von CD8+ T Zellen in vitro und in vivo anhand des murinen Infektionsmodells mit dem Bakterium Listeria monocytogenes. Für die Versuche benutzen wir Mäuse, in denen das Protein NFATc1 spezifisch im T Zellkompartiment entfernt wurde. Erste Ergebnisse zeigten eine typische Translokation von NFATc1 und NFATc2 in den Zellkern. Eine Veränderung in der mRNA Expression nach Aktivierung, sowohl in CD4+ T Zellen als auch in CD8+ T Zellen, fand ebenfalls statt. NFATc defiziente CD4+ und CD8+ T Zellen wiesen eine verminderte Expression von Th1/Tc1 Zytokinen wie z.B. Interleukin-2 und Interferon γ auf, welche für die Bekämpfung intrazellulärer Pathogene wichtig sind. In unserem in vitro Modell fanden wir eine verminderte Abtötungsfähigkeit und eine Reduktion in der Freisetzung lytischer Granula in NFATc1-/- CD8+ T Zellen wohingegen eine NFATc2 Defizienz keine Auswirkungen auf die Zytotoxizität - verglichen mit wildtypischen Zellen - aufweist. Interessanterweise fanden wir eine Anhäufung von lytischen Granula und eine verminderte intrazelluläre Migration von Mitochondrien nach Ausbildung einer immunologischen Synapse in NFATc1-/- CD8+ T Zellen. Zusammen mit den Ergebnissen unserer CsA-Inhibierungsversuche nehmen wir an, dass einige allgemeine zelluläre Prozesse von NFATc1 beeinflusst werden, die nicht direkt von der T Zellrezeptor-induzierten Signalkaskade abhängen. Anhand eines in vivo Mausmodells zeigten wir auch die wichtige Rolle von NFATc1 in T Zellen während der Infektion mit Listeria monocytogenes. Fünf Tage nach Infektion konnten aus Nfatc1fl/fl x Cd4 cre Mäusen mehr Bakterienpartikel extrahiert werden als aus wt Mäusen. Wie in den in vitro Versuchen konnte auch hier eine geringere Zytokinproduktion der CD8+ T Zellen festgestellt werden allerdings wiesen die Mäuse auch eine geringere Bildung von Gedächniszellen auf. Unsere Ergebnisse zeigen, dass NFATc1 in CD8+ T Zellen eine wichtige Rolle spielt und auch Auswirkungen auf grundlegendere zelluläre Funktionen, wie die Ausbildung einer immunologischen Synapse, hat.

The hematopoietic-specific Rho-family GTP exchange factor (GEF) Vav-1 is a regulator of lymphocyte antigen receptor signaling and mediates normal maturation and activation of B and T cells. Recent findings suggest that Vav-1 also forms part of signaling pathways required for natural and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of human NK cells. In this study, I show that Vav-1 is also expressed in murine NK cells. Vav-1-/- mice had normal numbers of splenic NK cells, and these displayed a similar expression profile of NK cell receptors as cells from wild type mice. Unexpectedly, IL-2-activated Vav-1-/- NK cells retained normal ADCC. Fc-receptor mediated activation of ERK, JNK, and p38 was also normal. In contrast, Vav-1-/- NK cells exhibited reduced natural cytotoxicity against EL4, C4.4.25, RMA and RMA/S. Together, these results demonstrate that Vav-1 is dispensable for mainstream NK cell development, but is required for NK cell natural cytotoxicity. Vav-2, a protein homologous to Vav-1 has also been implicated in NK cell functions. However, NK cells from Vav-2-/- mice have normal cytotoxic activities and NK cells that lack both Vav-1 and Vav-2 exhibit similar defect as Vav-1-/- cells. Thus Vav-2 has no apparent function in the development and the activation of NK cells. Although NK cell development is normal in Vav-1-/- mice, their numbers of NKT cells were dramatically diminished. Furthermore, NKT cells from Vav-1 mutant mice failed to produce IL-4 and IFNg following in vivo CD3 stimulation. A similar loss of NKT cells was observed in Vav-1-/-Vav-2-/- mice, but not in Vav-2-/- mice, suggesting that only Vav-1, and not Vav-2, is an essential regulator of NKT cell development and NK cell cytotoxicity. Similar to Vav-1, Lsc is a Rho GEF that is expressed specifically in the hematopoietic system. It contains a regulator of G-protein signaling (RGS) domain which negatively regulates the Ga12 and Ga13 subunits of G-protein coupled receptors (GPCRs). This study shows that NK and NKT cell development are normal in Lsc-/- mice. However, NK cells from mutant mice display enhanced cytotoxic responses towards a panel of tumor cells. These data implicate for the first time a RGS-containing Rho GEF in cytotoxic responses and suggest that Lsc down-modulate NK cell activation. / Vav-1 ist ein spezifisch in hämatopoetischen Zellen exprimierter Guanin-Nukleotid-Exchange-Faktor (GEF) für Rho-GTPasen, der die Antigenrezeptor-vermittelte Signaltransduktion in Lymphocyten reguliert und essentiell für der Reifung und Aktivierung von B- und T-Zellen ist. Untersuchungen an menschlichen Zellen lassen vermuten, dass Vav1 auch für Antikörper-unabhängige, natürliche Zytotoxizität und die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytoxizität (ADCC) von „Natürlichen-Killerzellen“ (NK-Zellen) wichtig ist. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass Vav-1 auch in murinen NK-Zellen exprimiert ist. Analysen von Vav-1-/--Mäuse zeigen eine normale Anzahl von NK-Zellen, die wiederum ein ähnliches Expressionsprofil von typischen NK-Zell-Rezeptoren im Vergleich zu wildtypischen Mäusen aufweisen. Die ADCC von Vav-1-/- NK-Zellen ist unverändert, wie auch die Fc-Rezeptor vermittelte Aktivierung von ERK, JNK und p38. Im Gegensatz dazu zeigen Vav-1-/- NK-Zellen eine reduzierte natürliche Cytotoxizität gegenüber EL4-, C4.4.25-, RMA- und RMA/S-Zielzellen. Vav-1 ist daher nicht für die Entwicklung, sondern für den Aufbau der natürlichen Cytotoxizität von NK-Zellen von Bedeutung. Für Vav-2 wurde ebenfalls eine Rolle in NK-Zellfunktionen wahrscheinlich gemacht. Dennoch zeigen Vav-2-/- Mäuse ein normales zytotoxisches Verhalten. NK-Zellen von Vav-1/Vav-2-doppeldefizienten Tieren weisen ähnliche Defekte wie NK-Zellen von Vav-1-defizienten Tieren. Somit besitzt Vav-2 keine entscheidende Funktion für die Entwicklung und Aktivierung von NK-Zellen. Im Gegensatz zu NK-Zellen ist die Anzahl der NKT-Zellen in Vav-1-/- Mäusen drastisch reduziert. Außerdem sind NKT-Zellen Vav-1-defizienter Mäuse nicht in der Lage IL-4 und INFg nach CD3-Stimulierung in vivo zu produzieren. Ein ähnlicher Verlust der NKT-Zell-Population wurde in Vav-1-/-- Vav-2-/--Mäusen beobachtet, nicht aber in Vav-2-/- Mäusen. Daher scheint nur Vav-1, nicht aber Vav-2, ein essentieller Regulator sowohl der NKT-Zell-Entwicklung als auch der NK-Zell-Cytotoxizität zu sein. Ein weiterer Rho-GEF, Lsc, ist ebenfalls spezifisch im hämatopoetischen System exprimiert. Lsc besitzt auch eine negativ-regulatorische RGS-Domäne (regulator of G-protein signaling) für die Ga12- und Ga13-Untereinheiten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. NK- und NKT-Zellen von Lsc-defizienten Mäusen entwickeln sich normal, weisen aber eine erhöhte Cytotoxizität gegenüber einer Reihe von Tumor-Zellen auf. Diese Daten zeigen zum ersten mal die Beteiligung eines RGS-Rho-GEF an zytotoxischen Reaktionen und deuten auf eine negative Modulation der NK-Zell-Aktivierung durch Lsc hin.

Flavonoide sind weitverbreitete sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe. Ihr Beitrag zur Prävention von chronischen Erkrankungen wird zu großen Teilen auf immunmodulatorische und neuroprotektive Effekte zurückgeführt. Eine Voraussetzung für die Nutzung dieser Eigenschaften der Flavonoide stellt die Erfassung cytotoxischer Effekte dar. Mit Ausnahme von Xanthohumol und Quercetin ist für alle im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten Flavonoide, Hispidulin, Baicalein, Scutellarein, Hesperetin, Chrysin, Apigenin, Naringenin, Catechin, Pelargonidinchlorid und EMD 21388, sowohl in T-Zellen (Jurkat) als auch in neuronalen (SK-N-SH)-Zellen nach 24-stündiger Inkubation eine geringgradige Cytotoxizität festzuhalten. Für Xanthohumol bzw. Quercetin wird ein halbmaximaler Verlust der Zellvitalität je nach Modell in Konzentrationen von 33-45 µM bzw. 118-208 µM erreicht. Der weiterführenden Charakterisierung (zVAD, DNA-Laddering) ist zu entnehmen, dass die zellulären Veränderungen substanzabhängig differieren und sowohl nekrotische Mechanismen (Xanthohumol) als auch apoptotische Vorgänge (Quercetin) einschließen. Eine erhöhte Lipidperoxidation im oberen Dosisbereich lässt darüber hinaus auf eine Beteiligung von oxidativem Stress an den von Xanthohumol-induzierten nekrotischen Prozessen schließen. Eine positive Einflussnahme auf die Zellvitalität durch Antioxidantien wie GSH und NAC lässt des Weiteren vermuten, dass die erfassten Flavonoid-induzierten Prozesse jeweils sensitiv zum Redoxzustand der Zelle sind. Während die Effekte von Xanthohumol auch in anderen Zellmodellen (HL-60) nachweisbar bleiben, verhält sich Quercetin nicht durchgehend vitalitätsmindernd. Unterschiede zwischen den Testsubstanzen bestehen auch hinsichtlich antioxidativer Effekte. Das Eliminieren freier Radikale zählt zu den wichtigsten Mechanismen, die bei Flavonoid-vermittelter Neuroprotektion eine Rolle spielen. Insgesamt sind alle diesbezüglich untersuchten Substanzen als starke Superoxidanionen-Radikalfänger einzustufen. Im Co-Inkubationsversuch zeigt Scutellarein den stärksten Effekt, gefolgt von Quercetin, Hispidulin und Xanthohumol. Im Prä-Inkubations-Versuchsmodell liegen in der Reihenfolge ihrer Effektstärken Xanthohumol vor Quercetin, Hispidulin und schließlich Scutellarein. Die modellabhängigen Konstanten können, unter Beteiligung einer passiven Diffusion der hydrophoben Flavonoidaglykone, auf eine substanzgebundene Membranpermeabilität zurückzuführen sein. Das antioxidative Potential der Flavonoide resultiert u.a. aus einer komplexen Einflußnahme auf die Genexpression in der Zelle. In der vorliegenden Arbeit sind anhand von cDNA-Arrays für mehrere Vertreter übereinstimmend Wechselwirkungen mit Genen der zellulären Abwehr dargestellt. Demnach führen Scutellarein, Hispidulin, Quercetin und Xanthohumol zu einer deutlich reduzierten Expressionsstärke von STK4, CHD4, ARHGDIB, IL16, ISG20, PFN1 und SOD2. Unter den Flavonoid-induzierten Veränderungen ragen die Effekte auf ADAR1 heraus, dessen Genexpression von Scutellarein bis auf ein 0,1-faches der Referenzwerte reduziert wird. Gleichsinnige Auswirkungen von Scutellarein auf die Expression von ADAR1-Protein in Western Blots unterstreichen diese Interaktion und legen nahe, dass ADAR-vermittelte enzymatische Deaminierungen durch Flavonoide moduliert werden können. Diese Beobachtung wird ergänzt durch den nachgewiesenen Effekt von Flavonoiden auf die Expression einer Reihe weiterer Gene (ADAR2, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3F und APOBEC3G), die analoge posttranskriptionale Mechanismen steuern und gleichermaßen in Immunabwehr und Neuroprotektion eingebunden sind. Zu den wichtigsten Substraten von ADAR zählen Glutamatrezeptoren. Erwartungsgemäß ist nach der Einwirkung von Scutellarein auf humane Zellen, die Glutamatrezeptoren exprimieren, ein Rückgang der Deaminierung im Bereich der Glutamatrezeptoruntereinheit GluR 2 zu verzeichnen (Q/R-Position). Dem entspricht in elektrophysiologischen Modellen eine gesteigerte Ca2+-Permeabilität der jeweiligen Ionenkanäle und eine veränderte neuronale Exzitabilität. Hieraus ergibt sich ein breites Spektrum zusätzlicher Optionen für die Induktion von gesundheitsrelevanten Flavonoidfunktionen in der Zelle. So spielt die Modulation von Deaminierungen zugleich eine entscheidende Rolle im Vermehrungszyklus viraler Erreger. Die Annahme einer möglichen antiviralen Qualität von Scutellarein wird durch ein HBV-Infektionsmodell anhand drei Parameter der Virusreplikation (Virus-DNA-Konzentration, HBs- bzw. HBe-Antigenproduktion) bestätigt. Offen bleibt auch nach ausführlicher Prüfung, ob der deutliche antivirale Effekt als das Produkt von Flavonoid-induzierten Veränderungen der Deaminierungsraten oder als Folge eines Effekts auf die virale Polymerase zu interpretieren ist. Die hier dargestellten Wirkmechanismen leisten einen Beitrag zum Verständnis der Bedeutung von Flavonoiden für neue Anwendungen in Neuroprotektion und Immunabwehr. / Flavonoids are common secondary plant metabolites that confer numerous nutritional health effects. Their role in preventing chronic diseases is attributed to immunmodulatory and neuroprotective effects among others. In order to fully exploit these properties the limitations imposed by the compounds cytotoxic profiles must be addressed. For the majority of compounds investigated, hispidulin, baicalein, scutellarein, hesperetin, chrysin, apigenin, naringenin, catechin, pelargonidinchloride and EMD 21388, the present study confirms minimal cytotoxicity in T-cells (Jurkat) and in neuronal cells (SK-N-SH). As for xanthohumol and quercetin a 50% decline in cell-vitality is observed at concentrations of 33-45 µM and 118-208 µM, respectively. Further characterization using zVAD and DNA-laddering indicate that cell-vitality may be compromised both by necrotic mechanisms (xanthohumol) and by apoptotic effects (quercetin). An increase in lipidperoxidation in the upper dose range suggests that oxidative stress may be involved in xanthohumol toxicity. As this is counteracted by antioxidants such as GSH and NAC, these flavonoids impact on cell-vitality is likely codetermined by the cells redox state. While the effects of xanthohumol extend to other cell models, quercetin toxicity in HL-60 cells is less pronounced. Test compounds are also found to differ with regard to antioxidative profiles. The elimination of free radicals is a key mechanism in flavonoid-induced neuroprotection and is shown to vary with different incubation protocols. In short incubation experiments (5 min; co-incubation) scutellarein is identified as the most powerful scavenger, followed by quercetin, hispidulin and xanthohumol. In prolonged incubations (24 hrs; prä-incubation) xanthohumol and quercetin are followed by hispidulin and scutellarein. Model-specific constants suggest that passive diffusion of the hydrophobic flavonoid-aglyca may occur across cell membranes, alongside with other modes of permeation. Flavonoids antioxidative potential is mediated by complex effects on gene expression. The present work uses data from cDNA-arrays to highlight interactions with genes involved in cellular defense. Specifically, scutellarein, hispidulin, quercetin and xanthohumol downregulate expression for STK4, CHD4, ARHGDIB, IL16, ISG20, PFN1 and SOD2. In addition, flavonoids consistently downregulate ADAR1-expression, which drops to 0,1-fold of reference values and is paralleled by scutellarein-effects on ADAR1-protein-expression. Together, these findings indicate, that ADAR-mediated enzymatic deamination may be modulated by flavonoids. Similar effects are noted on related genes (ADAR2, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3F and APOBEC3G), relevant to posttranscriptional processing underlying immune defense and neuroprotection. Glutamate receptors count among the most important neuronal substrates of ADAR. Following exposure to scutellarein a decrease in deamination rates is confirmed with respect to the glutamate receptor subunit GluR 2 (Q/R-site). As a result, an enhanced Ca2+-permeability of the respective ion channels is anticipated, and modified neuronal excitability. Overall, the regulation of enzymatic deamination by flavonoids offers opportunities for multilevel balancing of cell homeostasis. Thus deaminations may interfere with the replication cycle of viral pathogens. Using an ex-vivo HBV-infection model and three parameters of viral replication (viral load, HBs and HBe indices), antiviral properties of scutellarein are illustrated. Despite extensive investigation, it remains to be seen whether these effects can be ascribed to deaminations of viral DNA or to an interaction with other substrates, e.g. the viral polymerase. In summary, the present observations serve to foster our understanding of flavonoids roles in neuroprotection and immune defense.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden potenzielle Wirksubstanzen zur Behandlung trypanosomaler und bakterieller Infektionen gesucht. Während auf dem Gebiet der Trypanosomiasis das Ziel in der Testung großer Substanzbibliotheken auf antitrypanosomale Wirkung und in der Erstellung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen bestand, lag im Bereich der bakteriellen Infektion der Schwerpunkt in der Entwicklung neuer Testmethoden. Die Untersuchungen erfolgten mittels Kapillarelektrophorese und magnetischer Kernresonanz. / The purpose of this investigation was the search for new potential drugs for treatment of trypanosomal and bacterial infections. According to trypanosomiasis, this study aimed at screening large compound libraries for their antitrypanosomal activity and analyzing structure activity relationships. In the field of bacterial infections the development of new screening methods was of main interest. The investigations were performed using capillary electrophoresis and magnetic resonance imaging.

NK-Zellen spielen eine wichtige Rolle im menschlichen Immunsystem, insbesondere durch die Zerstörung von virusinfizierten Zellen und Tumorzellen sowie durch die Produktion von Zytokinen. Eine gezielte Modulation der Effektorfunktionen von NK-Zellen kann den Weg für neue Therapiestrategien gegenüber malignen Erkrankungen oder auch Autoimmunerkrankungen bahnen. Dasatinib ist ein potenter Inhibitor einer Vielzahl von Kinasen, die an der Regulation von NK-Zelleffektorfunktionen beteiligt sind und für die bereits eine Inhibition von T-Zelleffektorfunktionen gezeigt werden konnte [Schade et al. 2008; Weichsel et al. 2008]. Ein besseres Verständnis der immunmodulatorischen Eigenschaften von Dasatinib kann nicht nur neue Einsatzbereiche identifizieren, sondern auch die bereits bewährte Therapie der CML optimieren. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von Dasatinib auf die Expansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion von humanen NK-Zellen analysiert. Dazu wurden aus peripheren Blutlymphozyten gesunder Spender polyklonale NK-Zellen in Kokultur mit bestrahlten RPMI 8866-Zellen mit und ohne Dasatinib expandiert und NK-Zelleffektorfunktionen mit Durchfluszytometrie-basierten Experimenten untersucht. Im Detail wurde die Zytotoxizität nach dem Prinzip des FATAL-Experiments [Sheehy et al. 2001], die Degranulationsaktivität über die Expression von CD107a/b, die Produktion von TNF-α bzw. IFN-γ mit einer intrazellulären Färbung und die Apoptose- und Zelltodanalyse über Annexin-V und 7-AAD gemessen. Die Daten dieser Arbeit zeigen, dass Dasatinib die Haupteffektorfunktionen von NK-Zellen gesunder Blutspender in vitro reguliert: Die Expansionskapazität von NK-Zellen wird dosisabhängig und bei 50 nM Dasatinib vollständig inhibiert, ohne dass dies durch ein Absterben der NK-Zellen bedingt ist. Die Zytotoxizität von NK-Zellen, die unter 10 nM Dasatinib expandiert sind, ist nach Entfernen des Medikamentes restauriert, und die Degranulationskapazität und die Zytokinproduktion sind gesteigert. Bei unbehandelt expandierten NK-Zellen führt die direkte Anwesenheit von Dasatinib zu einer dosisabhängigen Hemmung der Zytotoxizität gegenüber K562-Zellen. Darüber hinaus inhibiert Dasatinib dosisabhängig die Degranulation und Zytokinproduktion von NK-Zellen bei einer Stimulation mit K562-Zellen nicht aber bei einer Stimulation mit PMA/Ca2+Ionophor. Eine indirekte Veränderung des Lyseverhaltens der NK-Zellen durch Effekte von Dasatinib auf die K562-Zellen zeigt sich nicht nach 4h, aber nach 24h im Sinne einer erhöhten Spontanlyse, aber geringeren spezifischen Lyse. Eine 24h-Vorbehandlung von K562-Zellen mit Dasatinib führt außerdem zu einer verminderten Degranulationsaktivität und Zytokinproduktion von unbehandelten NK-Zellen. Die Hemmung der NK-Zelleffektorfunktionen bei direkter Anwesenheit von Dasatinib und deren Restauration respektive Steigerung nach Entfernen des Medikaments ist am ehesten auf eine reversible Inhibition von Src-Kinase-abhängigen Prozessen der intrazellulären Signalübertragung zurückzuführen. Eine kompromittierte NK-Zellfunktion könnte während einer Behandlung mit Dasatinib zu einer Verminderung der Infektabwehr und der immunologischen Tumorüberwachung führen. Möglicherweise lassen sich jedoch die unerwünschten Wirkungen durch ein verändertes Dosisregime, wie eine Hochdosispulstherapie, bei guter Therapieeffizienz minimieren. Eine supprimierte Aktivität der NK-Zellen durch Dasatinib könnte dagegen bei der Therapie von NK-Zelllymphomen oder auch von Autoimmunerkrankungen eine neue Behandlungsoption darstellen. Aufgrund der bereits bekannten inhibitorischen Wirkung auf T-Zellfunktionen gibt es dabei möglicherweise Synergien in der immunsuppressiven Wirkung. Das immunmodulatorische Potential von Dasatinib birgt daher große Chancen sowohl im Einsatz als Immunsuppressivum, als auch in der Optimierung der bereits bewährten Therapie der CML. / NK cells play an important role in the human immune system, especially by the lysis of virally infected cells and tumor cells, but also by the production of cytokines. Modulating NK cell effector functions may help to identify new strategies in the therapy of cancer or autoimmune diseases. Dasatinib is a potent inhibitor of multiple kinases regulating NK cell effector functions and the drug was already shown to inhibit T cell effector functions. A better understanding of the modulatory effect of dasatinib on the immune system may not only identify new applications of the drug but may also help to improve the current therapy of chronic myelogenous leukemia. Thus, the impact of dasatinib on the expansion, cytotoxicity and cytokine production of human NK cells was analyzed in this thesis. NK cells from healthy human blood donors were expanded by co-culturing irradiated RPMI 8866 cells with and without dasatinib. NK cell effector functions have been examined by flow cytometry. Cytotoxicity was analyzed by a FATAL-based experiment, degranulation activity by CD107a/b expression, TNF-α and IFN-γ production by intracellular staining and viability by Annexin V and 7-AAD. The data of this work show that dasatinib regulates the main NK cell effector functions of healthy blood donors in vitro. Expansion of NK cells is dose-dependently inhibited, including a complete inhibition at 50 nM dasatinib, which is not due to a decreased viability of NK cells. After removing the drug, cytotoxicity of NK cells being expanded at 10 nM dasatinib is restored while degranulation and cytokine production are increased. When no drug is present during expansion, dasatinib inhibits NK cell cytotoxicity against K562 cells in a dose-dependent manner. Furthermore, dasatinib leads to a dose-dependent inhibition of degranulation and cytokine production of NK cells after stimulation by K562 cells but not after stimulation by PMA/Ca2+Ionophor. Indirect effects of dasatinib on NK cell cytotoxic activity by an impairment of K562 cells is not detected after 4h, but after 24h showing an increased spontaneous lysis but a decreased specific lysis. 24h-pretreating of K562 cells with dasatinib decreases degranulation and cytokine production of untreated NK cells. The inhibition of NK cell effector functions by direct presence of dasatinib and their restoration or enhancement after removing the drug are most likely due to a reversible inhibition of SRC-kinase dependent processes during intracellular signal transduction. An impaired NK cell function during the treatment with dasatinib might alter immune defense or tumor immunosurveillance. However, adverse effects could also be reduced by a high-dose pulse therapy with an equal anti-tumor efficacy. Suppressing NK cell activity by dasatinib might also be helpful in the therapy of NK cell lymphomas or autoimmune diseases. As an inhibitory effect was already shown on T cell functions, there might be a synergistic action regarding the immunosuppressive effect. The potential of dasatinib is promising not only as an immunosuppressant but also by improving the current therapy of chronic myelogenous leukemia.

Hintergrund: Die Studienlage zu Kautabak und Zigarettenrauch ist eindeutig und zeigt karzinogenes Potential. Über Schnupftabak ist hingegen wenig bekannt, vor allem auf zellulärer Ebene gibt es keine ausreichenden wissenschaftlichen Publikationen. Somit lässt sich die eventuell mutagene Wirkung von Schnupftabak nur schwer einschätzen. In Konsequenz stützt sich die WHO in ihrer Einstufung des Schnupftabaks als nicht karzinogen auf eine sehr eingeschränkte Datenlage. Ziel: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Schnupftabak auf mögliche zyto- und genotoxische Effekte auf humane Lymphozyten und Nasenschleimhautzellen zu untersuchen um ggf. tumorinitiierende Effekte darzustellen. Material und Methoden: Es kam eine Schnupftabaksorte ohne Menthol und eine Sorte mit Mentholzusatz zum EInsatz. Die benötigten Nasenschleimhautzellen und Lymphozyten wurden von 10 Probanden gewonnen und eine Stunde lang mit einem Schnupftabak-DMSO-Gemisch (2000µg/ml bis 0,01µg/ml) inkubiert. Zur Analyse wurde der Trypanblautest, dee Comet Assay und der Mikrokerntest verwendet. Ergebnis: Der Trypanblautest zeigte keinen Abfall der Vitalität. Beim Comet Assay ergab sich bei Lymphozyten ein signifikanter Anstieg der DNA-Fragmentierung ab 100µg/ml, bei Nasenschleimhautzellen ab 1000µg/ml. Der Mikrokerntest wies keine signifikante Zunahme der Mikrokerne auf. Es konnte kein Unterschied zwischen den beiden Tabaksorten aufgezeigt werden. Diskussion: Es zeigte sich eine Schädigung der Erbsubstanz im Comet Assay, die möglicherweise reparabel ist. Irreparable DNA-Schäden im Sinne von Mikrokernen wurden nicht gefunden. Nach diesen Ergebnissen muss die Einstufung der WHO in Zweifel gezogen werden. Untersuchungen mit weiteren Endpunkten der Genotoxizität sind somit gerechtfertigt, um zu einer fundierten Beurteilung des Risikopotentials von Schnupftabak zu gelangen. / Background: While an abundant number of studies concerning tobacco smoke and chewing tobacco show carcinogenic potential, there is little data on the consequences of snuff, especially on the cellular level. Therefore, the mutagenic effect of snuff is hard to estimate and the WHO assessment of snuff being not carcinogenic bases on very limited data. Objectives: This paper investigates potential cytotoxic and genotoxic effects of snuff on human lymphocytes and nasal mucosa cells. Materials and methods: Two kinds of snuff were used, one with a high degree of essential oil. The necessary nasal mucosa cells and lymphocytes were taken from 10 subjects undergoing nasal obstruction surgery and incubated with a snuff mixture (from 0,01µg/ml to 2000µg/ml). Methods included the trypan blue test, the comet assay and the micronucleus test. Results: The trypan blue test showed no decrease in cell viability for both cell types. The comet assay revealed a significant increase in the Olive Tail Moment for lymphocytes starting at 100µg/ml and 1000µg/ml for nasal mucosa cells. There was no significant increase in micronuclei according to the micronucleus test. Conclusion: The present study demonstrated genotoxic damage, such as DNA strand breaks, which may be repaired, but no non-repairable elevated micronuclei. The present findings cast doubts the WHO assessment that snuff is not carcinogenic, however, further research on various genotoxic endpoints in human cells are warranted.

Die Zahnwerkstoffe HEMA (Hydroxyethylmethacrylat) und TEGDMA (Triethylenglycol-dimethacrylat) gehören zu den so genannten Restmonomeren. Sie liegen nach der Polymerisation noch ungebunden vor und werden anschließend freigesetzt. Sie gelangen in den Organismus über die Pulpa, die Gingiva oder über den Speichel und können biologisch wirksam werden. Bisherige Studien zeigen dosisabhängige mutagene Effekte in tierischen und menschlichen Zellen. HEMA und TEGDMA führen zu DNA-Strangbrüchen, Mikrokernbildung, Apoptosen und nehmen Einfluss auf den Zellzyklus (G1- und G2-Verzögerung). Ebenso wurden ein allergenes Potential und eine toxische Wirkung auf die Niere beschrieben. In dieser Arbeit wurden genotoxische Effekte von HEMA und TEGDMA in humanen Lymphozyten in Konzentrationsbereichen überprüft, wie sie auch im Körper auftreten können. Hierfür wurden die Lymphozyten 24 Stunden mit 10 µM, 100 µM und 1 mM HEMA und mit 1 µM, 10 µM und 100 µM TEGDMA behandelt. Mit dem Comet Assay werden DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüche sowie die Reparatur zuvor induzierter DNA-Schäden erfasst. Durch die Modifikation des Comet Assay mit dem Fpg-Protein werden zusätzlich oxidativ geschädigte Basen mit hoher Sensitivität nachgewiesen. Der Mikrokerntest weist manifeste DNA-Schäden auf DNA-Ebene in Form von Mikrokernen nach. Daneben lassen sich auch andere zelluläre Reaktionen wie Mitosen und Apoptosen sowie die Proliferationsrate der Zellen bestimmen. Der Chromosomen-aberrationstest dient zum Nachweis von Veränderungen in der Struktur und/oder in der Anzahl von Chromosomen eines Genoms. Mit dem Schwesterchromatidaustauschtest werden ebenfalls Chromosomenmutationen nachgewiesen. Durchflusszytometrische Methoden werden zum Nachweis von Apoptosen und zur Zellzyklusanalyse eingesetzt. Im herkömmlichen Comet Assay zeigen HEMA und TEGDMA keine signifikante Wirkung auf die DNA (OTM < 2). Es kann aber gezeigt werden, dass die Behandlung mit Fpg zu einer Verdoppelung des OTM führt. Bei 1 mM HEMA und 100 µM TEGDMA wird dadurch das OTM auf > 2 angehoben. HEMA und TEGDMA wirken sich nicht auf die Mikrokernbildung aus, jedoch wird durch den Mikrokerntest ab 1 mM HEMA und 100 µM TEGDMA eine Einflussnahme auf die Proliferation gezeigt. Die Rate früher (< 10%) und später Apoptosen Apoptosen (< 4 %) bleibt im Durchschnitt weitgehend konstant. Eine Ausnahme sind 1 mM HEMA, die die frühen Apoptosen auf > 10 % anheben. Eine Einflussnahme auf den Zellzyklus, in Form einer Verzögerung, üben 1 mM HEMA in der S-Phase und 100 µM TEGDMA in der G1-Phase aus. In den Chromosomentests werden einerseits ein dosisabhängiger Anstieg der Aberrationen und andererseits vermehrte Chromatidaustausche beobachtet. In dieser Arbeit wird die Verbindung von HEMA und TEGDMA zu oxidativen Stress im Comet Assay mit Fpg gezeigt. Da die tatsächlich in vivo erreichbaren Konzentrationen unter 100 µM liegen, ist zu schließen, dass HEMA und TEGDMA in diesem niedrigen Konzentrationsbereich keine nachteiligen Effekte ausüben, denn nur die hohen Konzentrationen (1 mM HEMA, 100 µM TEGDMA) sind in der Lage eine genotoxische Wirkung zu entfalten. Jedoch kann das Auslösen von Mutationen mit dem Chromosomenaberrationstest und Schwesterchromatidaustauschtest bestätigt werden. Um das Schädigungsprofil dieser häufig eingesetzten Zahnwerkstoffe detaillierter beschreiben zu können, müssen Untersuchungen auf Chromatidebene intensiviert werden. / The dental materials HEMA (2-hydroxyethylmethacrylate) and TEGDMA (triethylengylcol-dimethacrylate) belong to the so-called rest monomers. After the polymerisation they are still unbound and can be released afterwards. They reach the organism through the pulp, the gingiva or through the saliva and can become biological effective. Present studies indicate dose-dependent mutagene effects in animal and human cells. HEMA and TEGDMA induce DNA strand breaks, micronuclei formation, apoptosis and have influence on the cell cycle (G1 and G2 delay). Also an allergic potential and a toxic effect on kidneys were described. In this study genotoxic effects were checked by HEMA and TEGDMA in human lymphocytes in concentration areas as they can also appear in the body. The lymphocytes were treated 24 hours with 10 µM, 100 µM and 1 mM HEMA and with 1 µM, 10 µM and 100 µM TEGDMA. With the comet assay DNA single and double strand breaks as well as the repair before induced DNA damage are grasped. By the modification of the comet assay with the Fpg protein oxidative injured bases are proved in addition with high sensitivity. The micronucleus test proves manifest DNA damages at DNA level in the form of micronuclei. Beside other cellular reactions like mitosis and apoptosis as well as the proliferation of the cell can also be determined. The chromosomal aberration test serves for the proof of changes in the structure and/or in the number of chromosomes of a genome. With the sister chromatid exchange test chromosomal mutations are also proved. Flow cytometric methods are used to the proof by apoptosis and to the cell cycle analysis. In the conventional comet assay HEMA and TEGDMA indicate no significant effect at the DNA (OTM < 2). However, it can be shown that the treatment with Fpg leads to a duplication of the OTM. At 1 mM HEMA and 100 µM TEGDMA the OTM is thereby raised on >2. HEMA and TEGDMA do not affect the induction of micronuclei, however the micronucleus test indicate a intervention on the proliferation from 1 mM HEMA and 100 µM TEGDMA. The rate earlier (< 10 %) and late apoptosis (< 4 %) remains widely steady on average. An exception is 1 mM HEMA which raise the early apoptosis on > 10 %. 1mM HEMA have an influence on the cell cycle, in form of a delay, in the S phase and 100 µM TEGDMA in the G1 phase. In the chromosomal tests are observed dose-dependent increase of the aberrations on the one hand and increased chromatid exchanges on the other hand. In this study the connection is shown by HEMA and TEGDMA to oxidative stress in the comet assay with Fpg. Because the really in vivo available concentration lie under 100 µM, is to be closed that HEMA and TEGDMA exert no disadvantageous effects in this low concentration area, because only the high concentrations (1 mM HEMA and 100 µM TEGDMA) are able to unfold a genotoxic effect. However, the release of mutations can be confirmed by the chromosomal aberration test and the sister chromatid exchange test. To be able to describe the damage profile of these often used dental materials more detailed investigations on chromatid level must be intensified.

The human African trypanosomiasis is a neglected tropical disease, which is caused by the protozoan Trypanosoma brucei and transmitted by the bite of the tsetse fly. An untreated infection leads to death. However, only a few drugs with significant drawbacks are currently available for treatment. In this thesis, quinolone amides with an antitrypanosomal activity were synthesized and their biological and physicochemical properties were measured. New structure-activity relationships and a promising lead structure were discovered. / Die Humane Afrikanische Trypanosomiasis ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die durch das Protozoon Trypanosoma brucei verursacht und durch den Stich der Tsetsefliege übertragen wird. Eine unbehandelte Infektion führt zum Tod. Für die Behandlung stehen derzeit jedoch nur wenige Medikamente mit erheblichen Nebenwirkungen zur Verfügung. In dieser Arbeit wurden Chinolonamide mit einer antitrypanosomalen Aktivität synthetisiert und ihre biologischen und physikochemischen Eigenschaften ermittelt. Es wurden neue Struktur-Wirkungs-Beziehungen und eine vielversprechende Leitstruktur entdeckt.