Les subtélomères forment la transition entre les séquences spécifiques des chromosomes et les répétitions télomériques terminales. Ils semblent capables d’influencer les fonctions télomériques mais les connaissances sur les mécanismes mis en jeu sont encore limitées. Les subtélomères sont pourtant associés à de nombreuses pathologies comme la myopathie facio-scapulo-humérale (FSHD), une dystrophie musculaire secondaire à la contraction de répétitions macrosatellites D4Z4 dans la région subtélomérique 4q35. Afin d’étudier les propriétés de la séquence subtélomérique D4Z4, nous avons créé des constructions reproduisant l’organisation génomique au locus 4q35. Nous avons montré que D4Z4 est capable d’adresser un télomère à la périphérie du noyau. Cette activité est couplée à une activité insulatrice au niveau d’une séquence proximale de 80 pb et est dépendante de CTCF et des Lamines A. De plus, la relocalisation périphérique d’un télomère par D4Z4 s’accompagne d’une réplication plus tardive de celui-ci. Par ailleurs, la recherche de séquences capables de s’opposer à l’effet de position télomérique (TPE) a identifié un élément de 30 pb contenant un site CTCF dans la séquence insulatrice proximale de D4Z4. De même,   l’introduction d’un signal de poly-adénylation entre un gène rapporteur et les répétitions télomériques interfère avec le TPE et est accompagnée d’une diminution d’un transcrit hybride contenant le gène rapporteur et des répétitions télomériques, suggérant un rôle des transcrits télomériques TERRAs dans la régulation du TPE. En conclusion, ce travail a permis de caractériser l’implication de séquences subtélomériques, et notamment D4Z4, dans la régulation des télomères, leur compartimentalisation nucléaire, la réplication ou l’effet de position télomérique. De plus, il apporte un éclairage nouveau sur la physiopathologie de la FSHD et ouvre des perspectives dans la compréhension d’autres pathologies liées aux subtélomères. / Subtelomeres form the transition between chromosome specific sequences and terminal telomeric repeats. They might influence telomeric functions but underlying mechanisms are still unclear. Nevertheless, subtelomeres are associated with a number of human pathologies such as facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD), an autosomal dominant disease secondary to the contraction of an array of D4Z4 macrosatellite repeats in the subtelomeric region 4q35. In order to study the biological function of the D4Z4 sequence, we created contructs that mimic the genomic organization of the 4q35 locus. We showed that D4Z4 is able to localize a telomere at the nuclear periphery. This perinuclear activity was dependant on interactions with CTCF and A type lamins and lied within a 80 bp proximal sequence that harbors an insulator activity. Moreover, the peripheral positionning of a telomere by D4Z4 is accompanied by a late replication timing of the telomere. We also searched for sequences able to counteract telomeric position effect (TPE) and identified a 30 bp element containing a CTCF binding site in the proximal region of D4Z4. In another construct, the introduction of a poly-adenylation signal between a reporter gene and telomeric repeats counteracted TPE. This effect is accompanied by the production of a hybrid transcript encompassing the reporter gene and telomeric repeats, suggesting a role for the TERRAs telomeric transcripts in TPE regulation. This work contibuted to characterize the role of subtelomeric sequences, especially the D4Z4 macrosatellite, in telomere regulation, their nuclear compartimentalization, their replication or the telomeric position effect. We will discuss the implications in the understanding of the pathophysiology of FSHD and other subtelomeric diseases.

La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale, ou FSHD, est une maladie d'hérédité autosomique dominante, caractérisée par un affaiblissement des muscles de la face, et progressant de façon asymétrique au reste du corps. Des analyses de liaison ont montré que 95% des cas sont associés à la délétion de D4Z4, macrosatellite polymorphe de 3,3Kb, répété en tandem dans la région subtélomérique du bras long du chromosome 4, mais aucun gène candidat n'a clairement été identifié, et l'existence de patients sans contraction (FSHD2), suggère des mécanismes complexes dans la survenue de la maladie. Parmi ceux-ci, l'implication d'altérations épigénétique a été suggérée. En effet, des changements de marques épigénétiques chez les patients, tels que l'hypométhylation de l'ADN et la diminution de la triméthylation des résidus H3K9, indiquent que des modifications de l'organisation chromatinienne et des altérations épigénétiques interviendraient dans la FSHD. De plus la localisation particulière du locus 4q35 dans le noyau pourrait contribuer à la régulation de ce locus. La disposition et la localisation des gènes n'est pas aléatoire au sein du noyau, c'est un processus dynamique impliqué dans la régulation des gènes au cours de la prolifération cellulaire et la différenciation. L'objectif nos travaux a donc été de comprendre la conformation tridimensionnelle du locus 4q35 chez les malades et les individus non atteints, pour déterminer de potentielles interactions entre séquences, proches ou distantes, impliquées dans la survenue de la FSHD. / Facio-Scapulo-Humeral-Dystrophy (FSHD) is an autosomal dominant, neuromuscular disorder, characterized by facial muscular weakness with an asymmetric progression to the rest of the body. Linkage analyses have shown that 95% of cases are associated with D4Z4 deletion, a 3.3 kb tandemly repeated sequence located in the subtelomeric region of the long arm of chromosome 4, 4q35. However, no candidate gene has been clearly identified, and families with typical FSHD phenotype, but no linkage to 4q35 (FSHD2) suggest complex epigenetic mechanisms. The deletion of a certain number of this repetitive DNA sequence associated to changes in the epigenetic marks across the D4Z4 array such as DNA hypomethylation or decrease in H3K9 trimethylation also indicates that FSHD involves changes in chromatin organization and epigenetic alterations. Among these changes, the positioning of the 4q35 region within the nuclear space might contribute to the regulation of the disease-associated locus. Indeed, DNA sequences are not randomly distributed within the nuclear space and gene localization is a dynamic process that contributes to the control of gene expression during cell proliferation and differentiation. The aim of our study was to compare chromatin conformation of the 4q35 locus in patients and unaffected individuals, and to identify interactions between sequences, in close proximity or distant to the D4Z4 array in FSHD pathogenesis. Therefore, we have developed an immuno-FISH technique in 3D, in different cellular models, in order to study the tridimensional distribution of DNA sequences within the nuclear volume.

Les subtélomères forment la transition entre les séquences spécifiques des chromosomes et les répétitions télomériques terminales. Ils semblent capables d'influencer les fonctions télomériques mais les connaissances sur les mécanismes mis en jeu sont encore limitées. Les subtélomères sont pourtant associés à de nombreuses pathologies comme la myopathie facio-scapulo-humérale (FSHD), une dystrophie musculaire secondaire à la contraction de répétitions macrosatellites D4Z4 dans la région subtélomérique 4q35. Afin d'étudier les propriétés de la séquence subtélomérique D4Z4, nous avons créé des constructions reproduisant l'organisation génomique au locus 4q35. Nous avons montré que D4Z4 est capable d'adresser un télomère à la périphérie du noyau. Cette activité est couplée à une activité insulatrice au niveau d'une séquence proximale de 80 pb et est dépendante de CTCF et des Lamines A. De plus, la relocalisation périphérique d'un télomère par D4Z4 s'accompagne d'une réplication plus tardive de celui-ci. Par ailleurs, la recherche de séquences capables de s'opposer à l'effet de position télomérique (TPE) a identifié un élément de 30 pb contenant un site CTCF dans la séquence insulatrice proximale de D4Z4. De même, l'introduction d'un signal de poly-adénylation entre un gène rapporteur et les répétitions télomériques interfère avec le TPE et est accompagnée d'une diminution d'un transcrit hybride contenant le gène rapporteur et des répétitions télomériques, suggérant un rôle des transcrits télomériques TERRAs dans la régulation du TPE. En conclusion, ce travail a permis de caractériser l'implication de séquences subtélomériques, et notamment D4Z4, dans la régulation des télomères, leur compartimentalisation nucléaire, la réplication ou l'effet de position télomérique. De plus, il apporte un éclairage nouveau sur la physiopathologie de la FSHD et ouvre des perspectives dans la compréhension d'autres pathologies liées aux subtélomères.

Final publication is available at http://dx.doi.org/10.1016/j.nmd.2016.03.001 / 京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19928号 / 医博第4148号 / 新制||医||1017(附属図書館) / 33014 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 萩原 正敏, 教授 羽賀 博典, 教授 松田 秀一 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La dystrophie facio-scapulo-humérale (FSHD) est une maladie autosomique dominante fréquente et mystérieuse sur le plan clinique, moléculaire, et physiopathologique. Elle se caractérise par une atteinte sélective facio-scapulo-humérale débutant à l'adolescence et d'évolution descendante mais la variabilité clinique est extrême et les défauts de pénétrance existent. La FSHD1 définit le phénotype FSHD associé à la contraction du macrosatellite répété D4Z4 dans la région subtélomérique 4q35, à moins de 11 unités répétées. Plusieurs variants génomiques associés en cis et constituant des haplotypes permissifs sont requis pour le développement de la FSHD. La FSHD2 est un variant épigénétique de la FSHD1 qui n'est pas associé à la contraction de D4Z4. La physiopathologie de la FSHD fait intervenir des mécanismes épigénétiques complexes encore mal connus. Aucun gène majeur n'a fait preuve de sa responsabilité, même si le rétrogène DUX4 contenu dans D4Z4 semble contribuer à la pathogenèse. La méthode diagnostique universelle, le Southern blot sur ADN génomique, est insatisfaisante car elle pose des difficultés techniques et de nombreux problèmes d'interprétation, notamment dans les cas complexes des variants non canoniques tels les mosaïques somatiques, les translocations de D4Z4, les délétions proximales. Dans ce travail, nous avons mis au point une nouvelle approche diagnostique basée sur la technique du peignage moléculaire de l'ADN génomique. Cette technologie a pour principe d'étirer uniformément et de fixer les molécules d'ADN sur une lame, et d'hybrider des sondes fluorescentes dont la combinaison détermine un code-barre génomique spécifique de la région d'intérêt. / Facio-Scapulo-Humeral Dystrophy (FSHD) is one of the most common muscular dystrophy with selective involvement of facial and scapular fixator muscles starting in teenage and a descending progression. Inheritance is autosomal dominant, with frequent de novo cases, extreme clinical variability and incomplete penetrance. FSHD1 is defined by the FSHD phenotype associated with the contraction of the polymorphic macrosatellite repeat D4Z4 on chromosome 4q35. In FSHD patients, several genomic factors have to co-segregate including a reduced number of D4Z4 copies fewer than 11 units and genomic variations in cis all together defining permissive haplotypes. FSHD2 is an epigenetic variant, which is not associated with contraction of D4Z4. Pathogenesis of FSHD is complex and involves epigenetic mechanisms still not well known. Inappropriate expression of the retrogene DUX4 has been recently implicated in the pathogenesis of FSHD. The most common diagnostic method, based on Southern blotting of genomic DNA is unsatisfactory because of the numerous problems in interpreting the results, particularly in complex cases such as somatic mosaics, translocated D4Z4 arrays, and proximal deletions. We developed a novel diagnostic approach based on molecular combing of genomic DNA. In this technology, hundreds of single molecules of DNA are uniformly combed and fixed on a slide and subsequent hybridized with a set of fluorescent probes. The combination of specific probes determines a genomic morse code that is specific of the genomic region of interest. Molecular combing allows visualizing large regions of genomic DNA with a high resolution (1 kb) at the scale of a single molecule.