Submitted by CELSO YASSUO OKADA JUNIOR null (celso.y.j@hotmail.com) on 2017-03-13T17:54:51Z No. of bitstreams: 1 Celso Okada dissrtação de mestrado final 2017 corrigida completo.pdf: 38043667 bytes, checksum: 6cff1849abf5c3061d2c4e543e043712 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-03-20T13:58:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 okada_cy_me_araiq.pdf: 38043667 bytes, checksum: 6cff1849abf5c3061d2c4e543e043712 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-20T13:58:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 okada_cy_me_araiq.pdf: 38043667 bytes, checksum: 6cff1849abf5c3061d2c4e543e043712 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A obesidade tem sido relatada como um processo inflamatório em decorrência da presença de tecido adiposo visceral, promovendo a resistência à insulina, devido a isso, a obesidade é capaz de desencadear um conjunto de doenças. Dentre as formas de tratamento da obesidade, a reeducação alimentar, atividade f´ısica regular e psicoterapia são as mais recomendadas. O presente projeto de pesquisa tem como objetivo o planejamento, síntese e caracterização de novos candidatos a fárrmacos com padrão estrutural ftalimídico para o tratamento da obesidade, por meio da inibição da enzima sn-1-Diacilglicerol Lipase α (DAGL-α), esta enzima é responsável pela produção do sinalizador lipídico 2-araquidonoilglicerol (2-AG), que é diretamente responsável pela modulação de receptores canabinoides do subtipo CB1. Nota-se em pacientes obesos elevada quantidade de 2-AG, dado que sugere uma possével explicação para o descontrole da saciedade alimentar, além disso, observa-se que modulações geradas por antagonistas ao receptor CB1 foram capazes de reduzir a resistência à insulina e a obesidade, todavia, efeitos colaterais como: depressão profunda e descontrole emocional foram relatados. Nesta perspectiva, a estratégia adotada neste trabalho consistiu em inibir a enzima que catalisa a síntese de 2-AG, para isso, foi utilizado o planejamento racional de fármacos adotando-se o ligante sintetizado pelo grupo de pesquisa da universidade de Leiden, ao qual foi relatada atividade biológica promissora frente à enzima DAGL-α. No presente projeto de pesquisa foi possível desenvolver uma rota sintética de quatro etapas, e com isso, sintetizar 12 derivados ftalimídicos que foram enviados para a universidade de Leiden em colaboração científica com o professor Dr. Mário Van der Stelt para execução dos testes de inibição enzimática. Dentro do contexto do CIBFar foram realizados testes biológicos paralelos perante as doenças negligenciadas e o câncer. Os resultados para o derivado CYOJ4 foram promissores para a malária e câncer de mama, proporcionando novas perspectivas para futuros trabalhos. / Obesity has been highlighted as an inflammatory process, this association has been evidenced by visceral adipose tissue. The physiologic response of the inflammation promotes problems in the homeostatic control of food intake. In addition, obesity and metabolic syndrome are capable of triggering a group of disease. Here, we promote the planning, synthesis, and characterization of a novels drug candidates with a phthalimide structural standard for the treatment of obesity, by inhibiting the enzyme sn-1-Diacilglicerol Lipase α (DAGL-α). This protein is responsible for the production of the 2-arachidonoylglycerol a lipid marker (2-AG), which is directly associated with the modulation of cannabinoid receptors called CB1. In obese patients there is a high plasma level of 2-AG, it suggests a possible explanation for high food intake, in addition, has been observed that modulations generated by antagonists to the CB1 receptor were able to reduce insulin resistance and obesity, however, side effects such as profound depression and change in emotional responses were reported. In this perspective, the strategy used in this project was to inhibit the enzyme that catalyzes the synthesis of 2-AG, for this, the rational drug planning has adopted with the ligand synthesized by the research group of the University of Leiden, which show a biological activity promising against the DAGL-α enzyme. In this research project has been possible to develop a synthetic route of four steps, and synthesize 12 phthalimide derivatives which were sent to the university of Leiden in scientific collaboration with the professor Dr. Mario Van Der Stelt to carry out the tests of enzymatic inhibition. Within the context of CIBFar, parallel biological tests have been carried out in the tropical diseases and cancer. The results were promising for malaria and breast cancer, providing novel perspectives for future projects. / CNPq: 132099/2015-2

Le système endocannabinoïde (eCB) est présent dans le système nerveux central (SNC) de mammifères, incluant la rétine, et est responsable de la régulation de nombreux processus physiologiques. Bien que la présence du récepteur cannabinoïde de type 1 (CB1R) a bien été documenté dans la rétine de rongeurs et primates, il y a encore une controverse quant à la présence du récepteur cannabinoïde de type 2 (CB2R) au niveau du SNC. En utilisant la microscopie confocale, nous sommes les premiers à signaler les patrons d’expression du CB2R dans la rétine de singe. Nos résultats démontrent que le CB2R est exprimé exclusivement dans les cellules de Müller de la rétine du singe. En outre, nous avons comparé les différents patrons d’expression du système eCB dans la rétine de la souris, du toupaye, ainsi que du singe vervet et macaque. Nous rapportons que les distributions de CB1R, FAAH (fatty acid amid hydrolase), MAGL (monoacylglycerol lipase) et DAGLα (diacylglycerol lipase alpha) sont hautement conservées parmi ces espèces alors que CB2R et NAPE-PLD (N-acyl phosphatidylethanolamine phospholipase D) présentent différents profils d'expression. CB2R n'a pas été détecté dans les cellules neuronales de la rétine des primates. L’immunoréactivité de NAPE-PLD est présente dans les couches de la rétine de souris et toupayes, mais a été limitée à la couche des photorécepteurs des singes vervet et macaque. Pour étudier les corrélats neuronaux et le rôle de la signalisation du système eCB dans la rétine, nous avons établi un protocole standard pour l'électrorétinographie (ERG), puis enregistré la réponse ERG de la rétine après le blocage des récepteurs avec des antagonistes spécifiques pour CB1R (AM251) et CB2R (AM630). Comparé au témoin, dans des conditions photopiques, et à certaines intensités faibles du stimulus, le blocage de CB1R diminue l'amplitude de l'onde-b, alors qu’à des intensités plus élevées, le blocage de CB2R augmente l'amplitude des deux-ondes a et b. De plus, le blocage des récepteurs cannabinoïdes provoque une augmentation de la latence des deux ondes a et b. Dans des conditions d’adaptation à l'obscurité, le blocage de CB1R et CB2R réduit l’amplitudes de l'onde a seulement à des intensités plus élevées et réduit l’onde b à intensités plus faibles. Des augmentations significatives de latence ont été observées dans les deux cas. Ces résultats indiquent que les récepteurs CB1 et CB2 chez les primates non humains sont impliqués dans la fonction rétinienne conditions photopiques. En outre, nous avons évalué le profil d'expression du CB1R, de FAAH et de NAPE-PLD au-delà de la rétine dans le corps géniculé latéral des singes et nous rapportons pour la première fois que CB1R et FAAH sont exprimés davantage dans les couches magnocellulaires. La NAPE-PLD a été localisée à travers les couches magno- et parvocellulaires. Aucune de ces composantes n’est exprimée dans les couches koniocellulaires. Ces résultats nous aident à mieux comprendre les effets des cannabinoïdes sur le système visuel qui pourraient nous mener à trouver éventuellement de nouvelles cibles thérapeutiques. / The endocannabinoid (eCB) system is present in the mammalian central nervous system, including the retina, and is responsible for the regulation of many physiological processes. Anatomical and functional data collected in the retina indicate that cannabinoid receptors are important mediators of retinal function. Although the presence of the cannabinoid receptor type 1 (CB1R) has been documented in the rodent and primate retina, there is still some controversy regarding the presence of the CB2 receptor (CB2R) within the central nervous system. By using confocal microscopy, we are the first to report the distribution patterns of CB2R in the monkey retina. Our results show that CB2R is expressed exclusively in the Müller cells of the primate retina. Furthermore, we compared the eCB system distribution patterns in the retinas of mice, tree shrews, and vervet and macaque monkeys. We report that CB1R, FAAH, MAGL, and DAGLα distributions are highly conserved among these 3 species whereas CB2R and NAPE-PLD exhibit different expression patterns. CB2R was not detected in the neuroretinal cells of primates. NAPE-PLD immunoreactivity was present in the retinal layers of mice and tree shrews but was restricted to the photoreceptor layer in both species of primates studied. To study the neural correlates and the role of eCB signaling in the retina, we first established a standard protocol for electroretinography (ERG) and then recorded the ERG response of the retina after blocking receptors with specific antagonists for CB1R (AM251) and CB2R (AM630). Compare to control, in photopic conditions, at certain low flash intensities, only the blockade of CB1R decreases the amplitude of the a-wave and b-wave, while at some high flash intensities, blockade of CB2R increase the amplitude of both a- and b-waves. Also the blockade of the cannabinoid receptors causes an increase in the latency of both a- and b-waves. In dark-adapted eyes, blockade of the CB1R and CB2R reduces the a-wave only amplitudes in the higher intensities and decrease the b-wave in lower intensities. Some significant increases in latency were observed in both cases. These results indicate that CB1 and CB2 receptors in primates are involved in retinal function under photopic and scotopic conditions. In addition, we assessed the expression pattern of eCB components CB1R, FAAH, and NAPE-PLD beyond the retina in the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) of primates and report for the first time that while CB1R and FAAH are more abundantly expressed in the magnocellular layer, NAPE-PLD is distributed throughout both the magno- and parvocellular layers. None of these components are expressed in the koniocellular layer. These findings augment our understanding of the effects of cannabinoids on the visual system and may lead to novel therapeutics targeted to eCB signaling.

Le système endocannabinoïde (eCB) est une cible thérapeutique intéressante pour traiter diverses conditions variées, allant de la modulation du système immunitaire à la prise en charge de la douleur neuropathique. De plus, le système eCB est impliqué dans les processus développementaux comme l’indique une exposition aux cannabinoïdes au cours du développement qui provoque des troubles neurofonctionnels. En raison de leur nature lipophile, les eCBs ne sont pas emmagasinés, mais sont plutôt synthétisés et dégradés sur demande par des enzymes. Ainsi, l’étude du patron d’expression de ces enzymes permettrait de mieux comprendre l’expression et ainsi le rôle joué par les eCBs pendant la formation du système nerveux central. Le récepteur CB1 est grandement distribué dans le système nerveux, alors que le récepteur CB2 est traditionnellement associé au système immunitaire. La découverte récente de l’expression et de l’impact fonctionnel du récepteur CB2 dans certains neurones, notamment au niveau rétinien, modifie la vision traditionnelle des rôles des eCBs. Notamment, une étude de notre laboratoire a montré que la délétion du récepteur CB2 chez des souris transgéniques (cnr2-/-) provoque une augmentation de l’amplitude de l’onde a en électrorétinographie, celle-ci reflétant l’activité des photorécepteurs rétiniens. Cette étude a mis en évidence l’importance du récepteur CB2 dans la vision, du moins au niveau rétinien. Jusqu’à ce jour, aucune étude ne s’est intéressée à l’impact des cannabinoïdes sur l’acuité visuelle. Nous avons caractérisé la distribution rétinienne des enzymes diacylglycérol lipase alpha (DAGLα) et monoacylglycérol lipase (MAGL), responsables respectivement de la synthèse et de la dégradation du ligand eCB 2-arachidonoyl glycérol (2-AG), pendant le développement postnatal. L’enzyme DAGLα est présente dès la naissance et est grandement distribuée dans la rétine, notamment dans les photorécepteurs, les cellules horizontales, amacrines et ganglionnaires. L’enzyme MAGL apparait plus tardivement et est limitée aux cellules amacrines et de Müller. Nos résultats fonctionnels indiquent que l’acuité visuelle des animaux cnr2-/- est plus élevée autant chez les adultes que pendant le développement postnatal. L’administration répétée d’un agoniste inverse du récepteur CB2 produit une augmentation de l’acuité visuelle similaire à la délétion du récepteur CB2 par génie génétique et inversement, l’administration d’un agoniste du récepteur CB2 diminue l’acuité visuelle. Enfin, l’administration d’un inhibiteur de l’enzyme MAGL, responsable de la dégradation du 2-AG, induit une diminution de l’acuité visuelle similaire à celle obtenue par un agoniste du récepteur CB2 tandis que l’administration d’un inhibiteur de l’enzyme DAGL, responsable de la synthèse du 2-AG, provoque une augmentation de l’acuité visuelle. Ces résultats suggèrent que le 2-AG est fortement présent tôt lors du développement rétinien et qu’il pourrait être impliqué dans la maturation structurelle et fonctionnelle de la rétine. De plus, les expériences fonctionnelles ont démontré que les cannabinoïdes affectent non seulement la réponse rétinienne, mais aussi l’acuité visuelle de manière significative. En outre, ces résultats confirment que les cannabinoïdes induisent leurs effets sur la vision exclusivement par le récepteur CB2. Enfin, les résultats de cette thèse accroissent les connaissances actuelles dans un contexte de légalisation grandissante du cannabis à des fins récréatives, puisqu’ils mettent en évidence l’importance des impacts sur l’acuité visuelle. / The endocannabinoid (eCB) system is a great therapeutic target for the treatment of many diseases, ranging from immune system modulation to pain management. This system is implicated in developmental processes as indicated by neurofunctional afflictions following developmental exposition to cannabinoids. Since eCBs are lipophilic, they are not stored in vesicles but rather synthesized and degraded on demand by specific enzymes. Thus, the expression pattern of these enzymes could help to better understand the expression of eCBs, and their role during central nervous system maturation. The CB1 receptor is strongly distributed in the nervous system, while the CB2 receptor is traditionally associated with the immune system. The recent finding of the CB2 receptor expression and function in some neurons, especially in the retina, changes the dogma associated with cannabinoids. A study from our laboratory found that deletion of the CB2 receptor in transgenic mice (cnr2-/-) enhances the a-wave amplitude in electroretinography, this wave reflecting photoreceptor activity. This report highlighted the importance of the CB2 receptor in vision, at least in the retina. Until now, no study aimed at the impact of cannabinoids on visual acuity. We characterized the retinal distribution of diacylglycerol lipase alpha (DAGLα) and monoacylglycerol lipase (MAGL) enzymes, responsible for the synthesis and degradation of the eCB ligand 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) during postnatal development. The enzyme DAGLα is expressed since birth and is greatly distributed across the retina such as in photoreceptors, horizontal, amacrine and ganglion cells. The enzyme MAGL is expressed later during development and is present only in amacrine and Müller cells. Our functional results show that the visual acuity of cnr2-/- mice is enhanced in adults and during postnatal development. The repeated administration of a CB2 receptor antagonist yielded a better visual acuity, and inversely a CB2 receptor agonist decreased the visual acuity. Furthermore, the administration of a MAGL inhibitor, the enzyme in charge of 2-AG degradation, induced a strong decrease in visual acuity, similar to that obtained with a CB2 receptor agonist. Inversely, a DAGL inhibitor, the enzyme responsible for 2-AG synthesis, caused an increase in visual acuity. These results suggest that 2-AG is strongly expressed early during retinal development and could be implicated in structural and functional maturation of the retina. Furthermore, we demonstrated that cannabinoids do not only affect retinal function, but also visual acuity. These results confirm that cannabinoids modulate their visual effects exclusively via the CB2 receptor. Finally, in recent years, many countries legalized cannabis for recreational and therapeutic use. The findings from this thesis increase the understanding of cannabinoids since they highlight the great impact of cannabinoids on the visual acuity.