Submitted by MAYARA GONCALVES FONSECA (mayaragoncalvesf@hotmail.com) on 2018-06-15T13:54:42Z No. of bitstreams: 1 Tese Definitivo Mayara G Fonseca.pdf: 2127533 bytes, checksum: 4b7682436269d27b1ccfada8cd08ceab (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-06-15T17:43:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fonseca_mg_dr_jabo_int.pdf: 2127533 bytes, checksum: 4b7682436269d27b1ccfada8cd08ceab (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-15T17:43:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fonseca_mg_dr_jabo_int.pdf: 2127533 bytes, checksum: 4b7682436269d27b1ccfada8cd08ceab (MD5) Previous issue date: 2018-05-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Considerando a importância nacional da raça Mangalarga Marchador (MM) e sua crescente internacionalização, estudos que avaliam diferentes aspectos de seus andamentos singulares, marcha batida (MB) e marcha picada (MP), são necessários. Os objetivos desse estudo foram descrever e comparar as variáveis cinemáticas (VCine) da MB e da MP e verificar associações entre as medidas morfométricas e as VCine de equinos da raça MM; avaliar a influência do alelo mutante do DMRT3 em homozigose (AA) ou heterozigose (AC) no padrão de movimento da MP; identificar, por meio de estudo amplo de associação do genoma (GWAS), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e regiões genômicas que contenham possíveis genes responsáveis pelo fenótipo da MB na raça MM. Para análise cinemática, dezoito câmeras optoeletrônicas (240 Hz) foram posicionadas para a aquisição dos dados tridimensionais de três marcadores retrorreflexivos fixados no casco. Determinou-se duração, comprimento, frequência e velocidade de cada passada; dissociação relativa diagonal de decolagem e de apoio; e distribuição do tempo da passada em cada tipo de apoio (quadrupedal, tríplice, bipedal, monopedal e suspensão). Quarenta e oito cavalos pertencentes aos dois grupos de andamentos distintos: MP com genótipo AA e AC do SNP 22999655C>A (n=20) e MB com genótipo CC (n=28) foram analisados por meio do Equine SNP70 BeadChip e em seguida realizado GWAS. Para caracterização cinemática dos andamentos, os dados foram submetidos à analise descritiva. Para comparação entre fêmeas e machos e para comparação entre MB e MP, os tempos de apoio foram comparados pelo teste U de Mann-Whitney e as demais variáveis analisadas pelo teste t de Student (P≤0,05). A relação entre variáveis morfométricas e cinemáticas foi avaliada por correlação de Pearson. As variáveis cinemáticas temporais dos cavalos de MP de genótipo AA (n=9) e AC (n=9) foram comparadas por ANAVA de dois fatores (genótipo e passada, sendo a última de amostras repetidas) e em seguida teste de Tukey (P≤0,05). MB em velocidade média de 13,22 km/h apresentou maior porcentagem de apoios bipedal diagonal, seguida de monopedal pélvico, tríplice torácico, bipedal lateral e bipedal pélvico. Também foi identificada dissociação de apoio positiva que provavelmente está relacionada à manifestação de apoios monopedais e bipedais pélvicos. A MP na velocidade média de 12,68 km/h apresentou predomínio de apoios laterais seguidos por diagonais, tríplice torácico e monopedal pélvico. Na mesma velocidade, MP apresentou menor duração, comprimento e maior frequência de passadas; maior dissociação e ocorrência de apoios laterais e tríplices; e menor frequência de apoios diagonais, bipedais pélvicos e suspensão em relação à MB. Na amostra estudada, tanto na MB quanto na MP, os exemplares proporcionalmente maiores e com ângulos escapuloumeral, metacarpofalângico, coxofemoral, tibiotarsicometatársico menores apresentaram maior comprimento de passada e melhor distribuição dos tempos de apoio de acordo com Padrão da raça MM. Foi encontrada relação entre o padrão de andamento e os diferentes genótipos do DMRT3 (AA ou AC) na MP de equinos montados da raça MM. Indivíduos AC tiveram menor dissociação diagonal de decolagem e apresentaram maior proporção de apoio diagonal e, por isso, parecem apresentar distribuição de tempos de apoio mais próximo ao descrito como ideal no Padrão da raça quando comparados aos indivíduos AA. Os resultados do GWAS revelaram que, ao contrário do fenótipo de MP que é aparentemente determinado por gene único (DMRT3), a MB parece ser controlada por maior número de genes. Concluiu-se que morfometria e aspectos genéticos interferem no padrão de andamento de equinos de marcha batida ou picada da raça Mangalarga Marchador. / Considering the national significance of the Mangalarga Marchador (MM) breed and its increasing internationalization, studies that evaluate different aspects of their singular gaits, marcha batida (MB) and marcha picada (MP) are necessary. The objectives of this study were to describe and compare the kinematic variables (VCine) of MB and MP and to verify associations between the morphometric measurements and the VCine of MM horses; to evaluate the influence of the mutant allele of DMRT3 on homozygous (AA) or heterozygosis (AC) in the MP movement pattern; to identify, through genome-wide association study (GWAS), single nucleotide polymorphisms (SNPs) and genomic regions containing possible genes responsible for the phenotype of the MB in MM breed. For kinematic analysis, eighteen optoelectronic cameras (240 Hz) were positioned to acquire the three-dimensional data of three retroreflective markers fixed to the hooves. Duration, length, frequency and speed of each stride; diagonal advanced placement and lift-off and support phases (quadrupedal, tripedal, bipedal, Monopedal and suspension) were determined. Fortyeight horses belonging to the two gait groups, MP with AA and AC genotypes of the 22999655C>A SNP (n = 20) and MB with CC genotype (n = 28), were analyzed using the Equine SNP70 BeadChip and then performed GWAS. For kinematic characterization of the gaits, the data were submitted to descriptive analysis. For comparison between females and males, and for comparison between MB and MP, the support phases were compared by the Mann-Whitney U test and the other variables analyzed by Student's t-test (P ≤0.05). The relationship between morphometric and kinematic variables was evaluated by Pearson correlation. The temporal kinematic variables of MP horses of genotype AA (n = 9) and AC (n = 9) were compared by two-way ANOVA (genotype and stride, being the last of repeated samples) and then Tukey's test (P≤0.05). MB at the average speed of 13.22 km.h -1 presented higher percentage of diagonal bipedal support, followed by a single pelvic limb, triple thoracic limb, lateral bipedal and bipedal pelvic limbs. In MB, a positive diagonal advanced placement was also identified that is probably related to the manifestation of single-support and pelvic bipedal supports. MP at the average speed of 12.68 km.h -1 presented predominance of lateral supports followed by diagonals, triple of thoracic limb and single support of pelvic limb. At the same speed, MP horses presented shorter duration, shorter length and greater frequency of strides, greater dissociation and greater occurrence of lateral and triple supports, and lower frequency of diagonal supports, bipedal pelvic and suspension in relation to MB. In the studied sample, both MB and MP, the proportionally larger horses with smaller scapulohumeral, metacarpophalangeal, coxofemoral and tibiotarsometatarsal angles showed greater stride length and better distribution of support phases according to vii breed standard. Was found a relationship between the gait pattern and the different genotypes of DMRT3 (AA or AC) in the MP of ridden MM horses. AC individuals had lower diagonal advanced at lift-off and presented greater proportion of diagonal supports and therefore appeared to present distribution of support phases closer to that described as ideal in breed standard when compared to AA subjects. The GWAS results revealed that, unlike the MP phenotype that is apparently determined by single gene (DMRT3) in which the A allele of g.22999655C> A controls the characteristic, MB seems to be controlled by a greater number of genes. It was concluded that morphometry and genetic aspects interfere with the gait pattern of MB or MP Mangalarga Marchador horses. / FAPESP: 2015/17155-2

O gene DMRT3 tem sido descrito como o principal gene a atuar na determinação da marcha em diversas raças equinas. O alelo A do SNP 23:g.22999655C>A do DMRT3 foi apontado como responsável por essa característica. Na raça brasileira Mangalarga Marchador, a qual apresenta dois padrões de marcha com características bem definidas, os genótipos AA e CA vem sendo associados à marcha picada e o genótipo CC à marcha batida. O objetivo geral do presente prospectar regiões genômicas associadas às marchas batida e picada em equinos Mangalarga Marchador. Foram utilizados 1.230 dados fenotípicos sobre o tipo de andamento (marcha batida N = 1.006; marcha picada N = 227) e, considerando a totalidade da genealogia conhecida para cada animal, 3172 animais no pedigree. Primeiramente foram testadas estratégias de modelagem para esta característica a fim de determinar os efeitos a serem considerados no modelo, bem como a melhor forma de inclusão (efeito fixo ou aleatório). Posteriormente, foi estudada a relação entre as frequências alélicas e genotípicas do gene DMRT3 com os padrões de parentesco e endogamia de acordo com cada tipo de marcha. Um estudo de associação genômica ampla em passo único (considerando informações de animais genotipados e não-genotipados simultaneamente) foi conduzido para verificar regiões genômicas, polimorfismos de nucleotídeo único e genes relacionados com a determinação do tipo de marcha em cavalos Mangalarga Marchador. Vinte e dois polimorfismos de nucleotídeo único localizados nos cromossomos 4(N = 5), 6 (2), 16 (1), 23 (11), 26 (1) e 29 (2), foram responsáveis por 42,43% da variância genética aditiva. Foram associados ao tipo de marcha 69 genes, mas cerca de 39 não estavam anotados em equinos. Foi conduzido um blast a fim de recuperar a função mais provável destes genes. Foram encontradas oito vias metabólicas associadas ao tipo de marcha. Os principais genes envolvidos estavam relacionados à percepção de estímulos externos, metabolismo energético-oxidativo, sistema imune e aprendizado e ritmo da locomoção. Não foi possível identificar a(s) variante(s) causal(ais) do tipo de marcha, contudo este estudo foi o primeiro e verificar que a possível determinação genética do tipo de marcha em cavalos Mangalarga Marchador passa por diferenças em níveis metabólicos que garantem a adaptação dos animais ao tipo de andamento. / The DMRT3 gene has been described as the main gene to act in gait determination in several equine breeds. The allele A of the SNP 23:g.22999655C>A of DMRT3 gene was identified as responsible for this trait. In the Brazilian Mangalarga Marchador breed, which presents two gait patterns with characteristics well defined, the AA and CA genotypes have been associated with marcha picada gait and CC genotype with marcha batida gait. The general aim of this study was to prospect genomic regions associated with marcha batida and marcha picada gaits in Mangalarga Marchador equines. 1,230 phenotypic data were used on the type of gait (marcha batida N = 1.006; marcha picada N = 227) and, considering the totality of known genealogy for each animal, 3,172 animals in the pedigree. Firstly, modelling strategies were tested for this trait in order to determine the effects to be considered in the model, as well as the best form of inclusion (fixed or random effect). Based on the best modelling strategy to be used, the relationship between the allelic and genotypic frequencies of the DMRT3 gene with kinship and inbreeding patterns was studied according to each type of gait. A single-step wide genomic association study (considering information from both genotyped and non-genotyped animals simultaneously) was conducted to verify genomic regions, single nucleotide polymorphisms and genes related to determination of gait type in Mangalarga Marchador horses. Twenty two single nucleotide polymorphisms located on chromosomes 4 (N = 5), 6 (2), 16 (1), 23 (11), 26 (1) and 29 (2) were responsible for 42.43% of the additive genetic variance. 69 genes were associated with gait type, but about 39 were not annotated in horses. A blast was conducted in order to recover the most likely function of these genes. Eight metabolic pathways were found associated with gait type and the main genes involved were related to the perception of external stimuli, energy-oxidative metabolism, immune system and learning and rhythm of locomotion. It was not possible to identify the causal variant(s) of the type of gait; however, this study was the first and to verify that the possible genetic determination of gait type in Mangalarga Marchador horses goes through differences in the metabolic levels that guarantee the adaptation of the animals to the type of gait.

O gene DMRT3 tem sido descrito como o principal gene a atuar na determinação da marcha em diversas raças equinas. O alelo A do SNP 23:g.22999655C>A do DMRT3 foi apontado como responsável por essa característica. Na raça brasileira Mangalarga Marchador, a qual apresenta dois padrões de marcha com características bem definidas, os genótipos AA e CA vem sendo associados à marcha picada e o genótipo CC à marcha batida. O objetivo geral do presente prospectar regiões genômicas associadas às marchas batida e picada em equinos Mangalarga Marchador. Foram utilizados 1.230 dados fenotípicos sobre o tipo de andamento (marcha batida N = 1.006; marcha picada N = 227) e, considerando a totalidade da genealogia conhecida para cada animal, 3172 animais no pedigree. Primeiramente foram testadas estratégias de modelagem para esta característica a fim de determinar os efeitos a serem considerados no modelo, bem como a melhor forma de inclusão (efeito fixo ou aleatório). Posteriormente, foi estudada a relação entre as frequências alélicas e genotípicas do gene DMRT3 com os padrões de parentesco e endogamia de acordo com cada tipo de marcha. Um estudo de associação genômica ampla em passo único (considerando informações de animais genotipados e não-genotipados simultaneamente) foi conduzido para verificar regiões genômicas, polimorfismos de nucleotídeo único e genes relacionados com a determinação do tipo de marcha em cavalos Mangalarga Marchador. Vinte e dois polimorfismos de nucleotídeo único localizados nos cromossomos 4(N = 5), 6 (2), 16 (1), 23 (11), 26 (1) e 29 (2), foram responsáveis por 42,43% da variância genética aditiva. Foram associados ao tipo de marcha 69 genes, mas cerca de 39 não estavam anotados em equinos. Foi conduzido um blast a fim de recuperar a função mais provável destes genes. Foram encontradas oito vias metabólicas associadas ao tipo de marcha. Os principais genes envolvidos estavam relacionados à percepção de estímulos externos, metabolismo energético-oxidativo, sistema imune e aprendizado e ritmo da locomoção. Não foi possível identificar a(s) variante(s) causal(ais) do tipo de marcha, contudo este estudo foi o primeiro e verificar que a possível determinação genética do tipo de marcha em cavalos Mangalarga Marchador passa por diferenças em níveis metabólicos que garantem a adaptação dos animais ao tipo de andamento. / The DMRT3 gene has been described as the main gene to act in gait determination in several equine breeds. The allele A of the SNP 23:g.22999655C>A of DMRT3 gene was identified as responsible for this trait. In the Brazilian Mangalarga Marchador breed, which presents two gait patterns with characteristics well defined, the AA and CA genotypes have been associated with marcha picada gait and CC genotype with marcha batida gait. The general aim of this study was to prospect genomic regions associated with marcha batida and marcha picada gaits in Mangalarga Marchador equines. 1,230 phenotypic data were used on the type of gait (marcha batida N = 1.006; marcha picada N = 227) and, considering the totality of known genealogy for each animal, 3,172 animals in the pedigree. Firstly, modelling strategies were tested for this trait in order to determine the effects to be considered in the model, as well as the best form of inclusion (fixed or random effect). Based on the best modelling strategy to be used, the relationship between the allelic and genotypic frequencies of the DMRT3 gene with kinship and inbreeding patterns was studied according to each type of gait. A single-step wide genomic association study (considering information from both genotyped and non-genotyped animals simultaneously) was conducted to verify genomic regions, single nucleotide polymorphisms and genes related to determination of gait type in Mangalarga Marchador horses. Twenty two single nucleotide polymorphisms located on chromosomes 4 (N = 5), 6 (2), 16 (1), 23 (11), 26 (1) and 29 (2) were responsible for 42.43% of the additive genetic variance. 69 genes were associated with gait type, but about 39 were not annotated in horses. A blast was conducted in order to recover the most likely function of these genes. Eight metabolic pathways were found associated with gait type and the main genes involved were related to the perception of external stimuli, energy-oxidative metabolism, immune system and learning and rhythm of locomotion. It was not possible to identify the causal variant(s) of the type of gait; however, this study was the first and to verify that the possible genetic determination of gait type in Mangalarga Marchador horses goes through differences in the metabolic levels that guarantee the adaptation of the animals to the type of gait.

In the spinal cord, an intricate neural network generates and coordinates the patterning of limb movements during locomotion. This network, known as the locomotor central pattern generator (CPG), comprises of various cell populations that together orchestrate the output of motor neurons. Identification of CPG neurons through their specific gene expression is a valuable tool that can provide considerable insight to the character, intrinsic properties and role of a population, which represents a step toward understanding locomotor circuit function and correlating neural activity to behaviour. We selectively targeted two inhibitory CPG populations to investigate their molecular characteristics, circuitry and functional role; Renshaw cells (RCs) marked by their specific expression of the cholinergic nicotinic receptor α2 (Chrna2) and a subset of the dI6 population derived by their selective expression of the Doublesex and mab-3 related transcription factor 3 (Dmrt3). We found that RCs have hyperpolarisation-activated cation (Ih) and small calcium-activated potassium (ISK) modulatory currents that differentially regulate their excitation and firing properties, which influence the instantaneous feedback to motor neurons through the recurrent inhibition circuit. Due to previous difficulties isolating RCs from the surrounding locomotor circuits, their functional role remains poorly defined. For the first time, we selectively silenced RC inhibition and found that all aspects of motor behaviour, including coordination and gait were normal. The deletion of RC signalling instead altered the electrical and synaptic properties of the recurrent inhibitory circuit, suggesting that developmental plasticity compensates for the loss of RC inhibition. We reveal Dmrt3 neurons comprise a population of glycinergic inhibitory, spike-frequency adapting commissural interneurons active during locomotion. Conditional silencing of the Dmrt3 population resulted in considerable gait abnormalities in the neonatal and adult mouse. This manifested as an uncoordinated CPG output in vitro, impaired limb coordination in pups and increased fore- and hindlimb synchrony in adults that was exacerbated at faster locomotor speeds. Dmrt3 mediated inhibition subsequently impacts locomotion and suggests the Dmrt3 population contribute to coordinating speed dependent left-right limb alternation. This thesis provides cellular, circuit and behavioural insights into the Renshaw cell and Dmrt3 populations and enhances our knowledge regarding their probable function within the locomotor CPG.