The effectiveness of radiotherapy treatment could be significantly improved if tumour cells could be rendered more sensitive to ionising radiation without altering the sensitivity of normal tissues. However, many of the key mechanisms that determine intrinsic tumour radiosensitivity are largely unknown. This thesis is concerned with the identification of novel determinants of tumour radiosensitivity. A siRNA screen of 200 genes involved in DNA damage repair was conducted using γH2AX foci post-irradiation as a marker of cell damage. This screen identified POLQ as a potential tumour-specific contributor to radioresistance. Subsequent investigations demonstrated that POLQ knockdown resulted in radiosensitisation of a panel of tumour cell lines, whilst having little or no effect on normal tissue cell lines. It was subsequently shown that POLQ depletion rendered tumour cells significantly more sensitive to several classes of cytotoxic agents. Following exposure to etoposide, it was found that tumour cells depleted of POLQ had reduced RAD51 foci formation, suggesting that POLQ is involved in homologous recombination. A homologous recombination assay was used to confirm that POLQ depletion does indeed result in reduced homologous recombination efficiency. These findings led to the investigation of the clinical significance of tumour overexpression of POLQ. The clinical outcomes of patients with early breast cancer were correlated with tumour expression levels of POLQ. It was found that POLQ overexpression was correlated with ER negative disease and high tumour grade, both of which are associated with poor clinical outcomes. POLQ overexpression was associated with extremely poor relapse free survival rates, independently of any other clinical or pathological feature. The mechanism that causes this adverse outcome may in part arise from resistance to adjuvant chemotherapy and radiotherapy treatment. These findings, combined with the limited normal tissue expression of POLQ, make it an appealing target for possible clinical exploitation.

Le Stress Réplicatif est caractérisé par une accumulation de fourches bloquées et est connu pour être une source majeure d'instabilité génétique dans les cellules humaines. Le Stress Réplicatif et l'instabilité génétique sont des marqueurs précoces de la tumorigenèse. Il est connu que les fourches de réplication bloquées peuvent dégénérer en cassures double brin. En effet, après un stress réplicatif prolongé (24h) induit par l'hydroxyurée (HU), l'endonucléase MUS81-EME1 peut promouvoir l'effondrement des fourches de réplication. Cette endonucléase prévient l'accumulation de régions sous-répliquées en G2 et des défauts de ségrégation chromosomique en mitose. Dans cette étude, en suivant l'apparition de cassures double brin (CDB) par les techniques sensibles d'essai comète neutre et de QIBC (Quantitative Image-Based Cytometry), nous avons pu mettre en évidence que l'effondrement des fourches est un événement qui peut être visualisé rapidement suite au stress réplicatif (dès 2h après HU). Nous avons pu caractériser cet effondrement rapide comme étant un mécanisme indépendant de MUS81, sous unité catalytique du complexe MUS81-EME1. De plus, en réalisant des extinctions de l'expression de gènes par siARN, nous avons identifié deux nucléases, Artémis et XPF, comme étant impliquées dans ce mécanisme d'effondrement rapide des fourches de réplication. Nos résultats suggèrent un rôle de ce mécanisme d'effondrement rapide dans la prévention d'intermédiaires mitotiques et de la transmission de lésions aux cellules filles. Nous avons également identifié l'ADN polymérase alternative, Pol theta comme étant un facteur impliqué dans la prévention de la mort cellulaire induite par ce mécanisme. L'exploration de données de qPCR sur des prélèvements de tissus cancéreux nous a permis d'identifier la surexpression de Pol theta comme étant corrélée à des gènes de la HR. Ceci suggère un potentiel mécanisme d'adaptation pour prévenir de l'accumulation de fourches effondrées dans les cellules cancéreuses. L'ensemble de ces données révèle que les cellules humaines ont acquis au cours de l'évolution la capacité de cliver rapidement des fourches bloquées qui pourrait s'avérer importante pour la stabilité du génome, notamment en contexte de stress réplicatif. / Replicative stress is characterized by an accumulation of stalled replication forks and is known to be a major source of genetic instability in human cells. Replicative stress and genetic instability are early markers of tumorigenesis. It is known that stalled replication forks can degenerate into double strand breaks (DSB), a process called replication fork collapse. Indeed, after an extended replicative stress (24h) induced by hydroxyurea (HU), the endonuclease MUS81-EME1 can promote the collapse of replication forks. This endonuclease prevents accumulation of under replicated regions in G2 and mitotic segregation defects. Here, by monitoring DSB with sensitive neutral comet assay and QIBC (Quantitative Image-Based Cytometry) approaches, we found that replication forks can also collapse rapidly after replicative stress (as early as 2 hours after HU). We characterised this rapid replication fork collapse as a MUS81-independent mechanism. Moreover, by performing siRNA based knock down, we identified two nucleases, Artemis and XPF, involved in rapid replication fork collapse mechanism. Our results point toward a role of this rapid collapse mechanism in preventing mitotic intermediates and lesion transmission to daughter cells. Also, we identified the role of an alternative DNA polymerase Pol theta as a molecular factor involved in preventing this mechanism to induce cell death. Data mining of expression data from tumour samples allowed us to identify Pol theta verexpression as correlated with HR genes, underpinning a potential adaptation mechanism to prevent collapsed fork accumulation in cancer cells. Collectively, these data reveal that human cells have evolved a quick cleavage response to stalled forks that might be important for genome stability notably in cells undergoing replicative stress.

La duplication de l'ADN au cours de la phase S est initiée à partir de l'activation de plusieurs dizaines de milliers d'origines de réplication. La mise en place des origines a lieu au cours de la phase G1 sous la forme de complexe de pré-réplication (pré-RC) et leur activation est orchestrée par un programme spatio-temporel. La régulation spatiale détermine les origines qui seront activées et la régulation temporelle, ou timing de réplication, détermine le moment de leur activation. En effet, toutes ces origines ne sont pas activées en même temps durant la phase S : certaines origines seront activées en début de phase S, d'autre en milieu, ou d'autre à la fin. Ce programme est établi en tout début de phase G1, au " point de décision du timing ". C'est un programme très robuste qui signe l'identité d'une cellule, son état de différenciation et le type cellulaire à laquelle elle appartient. Il a aussi été montré qu'il est altéré dans des situations pathologiques, en particulier le cancer, sans qu'on ne comprenne très bien les raisons mécanistiques. De manière générale, les mécanismes moléculaires qui régulent le timing de réplication sont méconnus. Le premier volet de ma thèse a permis l'identification d'un nouveau régulateur du timing de réplication : il s'agit de l'ADN polymérase spécialisée Thêta. Recrutée à la chromatine très tôt en phase G1, elle interagit avec des composants du pré-RC, et régule le recrutement des hélicases réplicatives à la chromatine. Enfin, sa déplétion ou sa surexpression entraîne une modification du timing de réplication à l'échelle du génome. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai exploré les mécanismes qui régulent ce programme temporel d'activation des origines suite à un stress réplicatif. J'ai identifié un mécanisme de régulation transgénérationnel inédit : la modification du timing de réplication de domaines chromosomiques ayant subi un stress réplicatif au cycle cellulaire précédent. Des cellules-filles issues d'une cellule ayant subi des problèmes de réplication dans des domaines fragiles (riches en AT, et donc potentiellement structurés, et pauvres en origines) présentent un timing plus précoce de l'activation des origines au niveau de ces domaines. Ce nouveau processus biologique d'adaptation est particulièrement intéressant dans un contexte tumoral de haut stress réplicatif chronique car ce pourrait être un moyen pour la cellule tumorale de survivre à son propre stress réplicatif mais aussi aux thérapies antitumorales qui sont nombreuses à cibler la réplication de l'ADN. / DNA duplication in S phase starts from thousands of initiation sites called DNA replication origins. These replication origins are set in G1 as pre-replication complexes (pre-RC) and fired in S phase following a spatio-temporal program of activation. This program determines which origins will be fired and when. Indeed, all the origins are not fired in the same time and we can distinguish early, middle and late replication origins. This temporal regulation is called "replication timing" and is determined at the "timing decision point" (TDP) in early G1. It's a robust program, which participates to the definition of cell identity, in term of differentiation state or cell type. However, the precise molecular mechanisms involved are poorly understood. Defective timing program has been evidenced in pathological contexts, in particular in cancers, but the mechanisms of this deregulation remain unclear. In the first part of my PhD, I contributed to the discovery of a new regulator of the origin timing program: the specialized DNA polymerase Theta (Pol Theta). Pol Theta is loaded onto chromatin in early G1, coimmunoprecipitates with pre-RC components and modulates the recruitment of Mcm helicases at TDP. Moreover, depletion or overexpression of Pol Theta modifies the timing of replication at a fraction of chromosomal domains. The second part of my work aimed at exploring the mechanisms that regulates replication timing after a replicative stress. I identified a totally new transgenerational adaptive mechanism of DNA replication timing regulation: the modification of the timing of origin activation at chromosomal domains that have suffered from a replicative stress during the previous cell cycle. Daughter cells from a cell that has experienced replication stress at particular domains (late replicating domains, AT rich so they can form structured DNA, and poor in origin density) shows advanced origin activation within these regions. This new biological process in response to replicative stress could be of particular interest in the context of cancer since, tumor cells are characterized by high level of intrinsic chronic replicative stress. This new mechanism may favor cancer cell survival despite replication stress, particularly upon treatments with anti-tumor agents that target DNA.