Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2003. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format.

Regensburg, Univ., Diss., 2009.

Universiẗat, Diss., 2000--Essen.

Ein sehr wichtiger Tumorsuppressor ist der Transkriptionsfaktor p53, der Zellschicksals-Entscheidungen wie Zellzyklus-Arrest und programmierten Zelltod (Apoptose) kontrolliert. Die Wirkung von p53 und von seinen Familienmitgliedern p63 und p73 beruht überwiegend auf der Fähigkeit, als Transkriptionsfaktoren die Genexpression zu regulieren. Die DNA-Bindung an Promotoren von Zielgenen ist dabei von grundlegender Bedeutung und wird durch die hoch konservierte zentrale DNA-Bindungs-Domäne und den Carboxy-Terminus bestimmt. In dieser Arbeit wurden die DNA-Bindungseigenschaften von p53 und verschiedener Carboxy-terminalen p73 Isoformen untersucht. In „electrophoretic mobility shift assay” (EMSA) Experimenten bildeten p53 und p73gamma nur schwache Sequenz-spezifische DNA-Komplexe, wohingegen p73alpha, beta und delta die DNA deutlich stärker banden. Die schwache DNA-Bindung von p53 und p73gamma kann durch mehrfach positiv geladene Carboxy-Termini erklärt werden, die über eine Sequenz-unabhängige DNA-Bindung ein Gleiten entlang der DNA ermöglichen. Die Deletion der Carboxy-terminalen Domäne (CTD) von p53 („p53delta30“) verstärkte dementsprechend die Sequenz-spezifische DNA-Bindung in vitro und seine Übertragung auf p73alpha („p73alpha+30“) schwächte sie ab. Mittels „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) Experimenten konnte in lebenden Zellen eine Verminderung der intra-nukleären Mobilität von p53 und p73alpha+30 durch die CTD gezeigt werden, die aus der Sequenz-unabhängigen DNA-Bindung resultiert. Zusätzlich reduzierte die CTD die Sequenz-spezifische DNA-Bindung von p53 an den p21 (CDKN1A) Promotor. Das Spektrum der regulierten Zielgene wurde in einer Genom-weiten Genexpressions-Analyse nicht durch die CTD verändert, sondern maßgeblich durch das Protein-Rückgrat von p53 beziehungsweise p73 bestimmt. Allerdings verminderte die CTD das Ausmaß der Transkriptions-Regulation und hemmte die Induktion von Zellzyklus-Arrest und Apoptose. Die mehrfach positiv geladene CTD in p53 besitzt demzufolge eine negativ regulatorische Wirkung, die in den wichtigsten p73 Isoformen alpha, beta und delta fehlt. Die zentrale DNA-Bindungs-Domäne trägt durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen H1-Helices (Aminosäurereste 177 bis 182) unterschiedlicher p53 Monomere zu kooperativer DNA-Bindung und zu Zellschicksals-Entscheidungen bei. Anhand von Mutanten, die unterschiedlich starke H1-Helix-Interaktionen ermöglichen, konnte gezeigt werden, dass starke Interaktionen die Bindung an Promotoren von pro-apoptotischen Genen verstärkte, wohingegen die Bindung an anti-apoptotische und Zellzyklus-blockierende Gene unabhängig von der Interaktions-Stärke war. Diese Unterschiede in der Promotor-Bindung ließen sich nicht auf eine veränderte zelluläre Lokalisation der Mutanten zurückführen, da alle Mutanten überwiegend nukleär lokalisiert waren. Eine an Serin 183 Phosphorylierungs-defekte Mutante von p53 bildete stabile DNA-Komplexe, entsprechend einer Mutante mit starker H1-Helix-Interaktion, und trans-aktivierte pro-apoptotische Promotoren stärker als Mutanten, die Phosphorylierung von p53 an Serin 183 simulieren. Da zusätzlich bekannt ist, dass Serin 183 mit der H1-Helix wechselwirkt, könnte diese Phosphorylierung einen physiologischen Mechanismus zur Regulation der H1-Helix-Interaktion und damit des Zellschicksals darstellen. Zusammenfassend ließ sich zeigen, dass sowohl die Interaktions-Stärke zweier DNA-Bindungs-Domänen als auch die elektrische Ladung des Carboxy-Terminus die DNA-Bindungseigenschaften von p53 Familienmitgliedern bestimmen und so Zellschicksals-Entscheidungen der p53 Familie beeinflussen. / A very important tumour suppressor is the transcription factor p53 that controls cell fate decisions like cell cycle arrest and programmed cell death (apoptosis). The effects of p53 and its family members p63 and p73 are mainly based on their transcription factor activities to regulate gene expression. The DNA binding to promoters of target genes is of fundamental importance for their functionality and is determined by the highly conserved core DNA binding domain and the carboxy-terminus. In this thesis the DNA binding properties of p53 and different carboxy-terminal p73 isoforms were examined. In electrophoretic mobility shift assays (EMSA) p53 and p73gamma formed only weak sequence-specific protein-DNA-complexes while p73alpha, beta and delta bound considerably stronger to DNA. A highly positively charged carboxy-terminus can explain the weak DNA binding of p53 and p73gamma by enabling sequence-nonspecific DNA binding leading to sliding on DNA. According to this the deletion of the carboxy-terminal domain (CTD) of p53 („p53delta30“) reinforced DNA binding in vitro, and its fusion to p73alpha („p73alpha+30“) attenuated it. In living cells the CTD reduced intranuclear mobility of p53 and p73alpha+30 in fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments by mediating sequence-nonspecific binding to DNA. In addition, the CTD reduced sequence-specific occupancy of the p21 (CDKN1A) promoter by p53 in vivo. In an unbiased genome-wide gene expression analysis the spectrum of target genes was not changed by the presence of the CTD, but mainly determined by the p53 and p73 protein backbone, respectively. However, the CTD diminished the level of target gene activation and inhibited the induction of cell cycle arrest and apoptosis. As a result, the highly positively charged carboxy-terminus of p53 exhibits a negative regulatory effect that is missing in the most important p73 isoforms alpha, beta and delta. The core DNA binding domain adds to cooperative DNA binding and cell fate decisions by electrostatic interactions between H1 helices (residues 177 to 182) of different p53 monomers. Strong H1 helix interactions increased binding to promoters of pro-apoptotic genes, whereas binding to anti-apoptotic and proliferation inhibiting genes was independent of the interaction strength as shown by mutants with different strengths of the H1 helix interactions. These differences in promoter binding were not caused by different cellular localizations of the mutants as they were all predominantly localized to the nucleus. A serine 183 phosphorylation-defective mutant of p53 formed stable protein-DNA-complexes, comparable to a mutant with strong H1 helix interactions, and trans-activated pro-apoptotic promoters stronger than mutants that mimicked p53 phosphorylated on serine 183. Due to the fact that serine 183 interacts with the H1 helix, these data suggest that phosphorylation of serine 183 is a physiological mechanism to regulate H1 helix interactions and thereby cell fate decisions. In summary, it was shown that both the interaction strength of two DNA binding domains and the electrostatic charge of the CTD define the DNA binding properties of p53 family members and thereby influence cell fate decisions of the p53 family.

Universiẗat, Diss., 2002--Dortmund.

Die Deregulation des Transkriptionsfaktors Myc ist ein charakteristisches Merkmal für eine Vielzahl von humanen Tumoren. Durch die transkriptionelle Aktivierung von Genen, die im Zusammenhang mit Metabolismus, Translation und Proliferation stehen, wird dadurch das Tumorwachstum begünstigt. Myc bildet zudem mit dem Zinkfinger-Protein Miz1 einen Komplex, der hemmend auf die Transkription von Zielgenen wirkt. Bisher sind nur wenige Myc/Miz1-reprimierte Zielgene bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnten genomweit die DNA-Bindestellen von Myc und Miz1 durch Chromatin-Immunpräzipitationen gefolgt von Hochdurchsatzsequenzierung in einer Zervixkarzinomzelllinie bestimmt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Myc an Promotoren aller drei RNA-Polymerasen sowie in enhancer-Regionen bindet, während Miz1 Kernpromotoren von RNA-Polymerase II- und III-transkribierten Genen besetzt. reChIP-Experimente zeigten, dass Myc und Miz1 als Komplex an Promotoren von Zielgenen binden. Zudem wurde ein Miz1-DNA-Bindemotiv identifiziert und der transaktivierende Einfluss von Miz1 auf Gene mit diesem Motiv nachgewiesen. Das überwiegende Vorhandensein von Myc/Max-Komplexen führt zu einer Transaktivierung von E-Box-haltigen Promotoren. Andererseits erfolgt die transkriptionelle Repression von Myc/Miz1-Zielgenen an Promotoren, an denen der Myc/Miz1-Komplex vorherrscht. In aktuellen Publikationen konnte gezeigt werden, dass nach mitogener Stimulation von Lymphozyten es zu einer Erhöhung der Myc-Expression kommt, wodurch Myc als ein genereller Transkriptionsaktivator fungiert, der alle Gene gleichermaßen induziert. Trotz hoher Myc-Mengen in Tumorzellen konnte die generelle Myc-vermittelte Transaktivierung nicht nachgewiesen werden. Zusätzlich zur Myc-abhängigen Transaktivierung von E-Box-haltigen Genen, z. B. beteiligt an Translation und RNA-Prozessierung, und der Miz1-vermittelten transkriptionellen Aktivierung von Genen mit Miz1-Motiv (z. B. involviert in Autophagie), konnte entgegen dem Modell der generellen Genamplifikation durch Myc eine Myc/Miz1-abhängige Repression von Zielgenen belegt werden. Die neu gewonnenen Erkenntnisse des Bindeverhaltens des Myc/Miz1-Komplexes und der daraus resultierenden transkriptionellen Regulation von Myc/Miz1-Zielgenen ermöglichen ein besseres Verständnis der Myc-Funktion in Tumorzellen und könnte zur Verbesserung von Tumortherapien führen. / Deregulation of the transcription factor Myc is a characteristic feature of a variety of human tumors. The Myc-dependent transcriptional activation of genes involved in metabolism, translation and proliferation therefor promotes tumor growth. Additionally, Myc forms a complex with the zinc finger protein Miz1, which represses transcription of target genes. So far, only a limited number of Myc/Miz1-repressed genes is known. Within the present thesis DNA binding sites of Myc and Miz1 were mapped genome-wide using chromatin immunoprecipitations followed by high-throughput sequencing in a cervical cancer cell line. It could be shown that Myc binds to promoters of all three RNA polymerases as well as to enhancer regions, whereas Miz1 binding sites could be found only in core promoters of RNA polymerase II and III transcribed genes. reChIP experiments illustrated binding of Myc and Miz1 as a complex on DNA. Additionally, a DNA binding motif of Miz1 was identified and furthermore it was possible to verify the transctivating influence of Miz1 on genes carrying that motif in the promoter. On E-box containing promoters the predominantly existence of Myc/Max complexes resulted in transactivation of the respective genes. Otherwise, transcriptional repression of Myc/Miz1 target genes occured at promoters where the Myc/Miz1 complex dominates. Recent publications have illustrated that after mitogenic stimulation of primary lymphocytes, Myc expression is enhanced, whereby Myc serves as a general transcriptional activator that induces the expression of virtually all genes. Although Myc levels are high in tumor cells that general mechanism of Myc-mediated transactivation could not be verified. Additionally to the Myc-dependent transactivation of E-box-containing genes, e. g. involved in translation and RNA processing, and Miz1-mediated transcriptional activation of genes containing a Miz1 binding motif (e. g. autophagy-related genes), and in opposition to the general amplifier model a Myc/Miz1-dependent repression of target genes could be proven. The obtained evidences concerning DNA binding properties of the Myc/Miz1 complex as well as the resulting transcriptional regulation of Myc/Miz1 target genes facilitates a better understanding of Myc function in tumor cells and could leed to better anti-tumor therapies.

A large fraction of human tumors exhibits aberrant expression of the oncoprotein MYC. As a transcription factor regulating various cellular processes, MYC is also crucially involved in normal development. Direct targeting of MYC has been a major challenge for molecular cancer drug discovery. The proof of principle that its inhibition is nevertheless feasible came from in vivo studies using a dominant-negative allele of MYC termed OmoMYC. Systemic expression of OmoMYC triggered long-term tumor regression with mild and fully reversible side effects on normal tissues. In this study, OmoMYC’s mode of action was investigated combining methods of structural biology and functional genomics to elucidate how it is able to preferentially affect oncogenic functions of MYC. The crystal structure of the OmoMYC homodimer, both in the free and the E-box-bound state, was determined, which revealed that OmoMYC forms a stable homodimer, and as such, recognizes DNA via the same base-specific DNA contacts as the MYC/MAX heterodimer. OmoMYC binds DNA with an equally high affinity as MYC/MAX complexes. RNA-sequencing showed that OmoMYC blunts both MYC-dependent transcriptional activation and repression. Genome-wide DNA-binding studies using chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing revealed that OmoMYC competes with MYC/MAX complexes on chromatin, thereby reducing their occupancy at consensus DNA binding sites. The most prominent decrease in MYC binding was seen at low-affinity promoters, which were invaded by MYC at oncogenic levels. Strikingly, gene set enrichment analyses using OmoMYC-regulated genes enabled the identification of tumor subgroups with high MYC levels in multiple tumor entities. Together with a targeted shRNA screen, this identified novel targets for the eradication of MYC-driven tumors, such as ATAD3A, BOP1, and ADRM1. In summary, the findings suggest that OmoMYC specifically inhibits tumor cell growth by attenuating the expression of rate-limiting proteins in cellular processes that respond to elevated levels of MYC protein using a DNA-competitive mechanism. This opens up novel strategies to target oncogenic MYC functions for tumor therapy. / Eine Vielzahl humaner Tumore entsteht durch die aberrante Expression des Onkoproteins MYC. Da MYC als Transkriptionsfaktor viele zelluläre Prozesse reguliert, ist er auch maßgeblich an der Entwicklung von normalem Gewebe beteiligt. Die direkte Hemmung von MYC stellt eine große Herausforderung für die Wirkstoffentwicklung dar. Studien mit dem dominant-negativen MYC-Allel namens OmoMYC belegten, dass MYC ein potenzieller Angriffspunkt für die zielgerichtete Tumortherapie ist. Die systemische Expression dieser MYC-Mutante löste eine dauerhafte Tumorregression aus und zeigte milde sowie vollständig reversible Nebenwirkungen. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Wirkmechanismus von OmoMYC untersucht, wobei sowohl Methoden der Strukturbiologie als auch der funktionalen Genomik angewendet wurden. Die Kristallstruktur des OmoMYC Proteins wurde im freien und E-Box-gebundenen Zustand bestimmt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass OmoMYC ein stabiles Homodimer bildet. Als solches erkennt es DNA mittels derselben basenspezifischen Interaktionen wie der MYC/MAX-Komplex. Dabei bindet OmoMYC DNA mit einer ähnlichen Affinität wie das MYC/MAX-Heterodimer. Die genomweite Expressionsanalyse mittels RNA-Sequenzierung identifiziert eine Reduktion sowohl der MYC-abhängigen Transkriptionsaktiverung als auch der Transkriptionsrepression durch OmoMYC. Mittels Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung wird gezeigt, dass OmoMYC mit MYC/MAXKomplexen auf Chromatin konkurriert und so deren Besetzung global an Konsensus-Bindestellen verringert. Die stärkste Reduktion zeigt sich an Promoterregionen mit schwacher Affinität für die MYC-Bindung, welche durch onkogene MYC-Proteinmengen aufgefüllt werden. Gene set enrichment-Analysen unter Berücksichtigung von OmoMYC-regulierten Genen erlaubten die Identifizierung von Tumor-Subgruppen mit hohen MYC-Proteinmengen in zahlreichen Tumorentitäten. Zusammen mit einem fokussierten shRNA-Screen können so neue Zielproteine für die Bekämpfung von MYC-getriebenen Tumoren, wie zum Beispiel ATAD3A, BOP1 und ADRM1, identifiziert werden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass OmoMYC spezifisch das Tumorzellwachstum inhibiert, indem es die Expression von zentralen Proteinen limitiert, welche durch erhöhte MYC-Proteinmengen reguliert werden. Somit können neue Strategien zur Tumortherapie identifiziert werden, die auf onkogene Funktionen von MYC zielen.