Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25 / Temos demonstrado, em nosso laboratório, que dietas lipídicas enriquecidas com óleo de peixe ou óleo de soja apresentam efeito antiinflamatório associado a alterações em mediadores inflamatórios, como corticosteróides, bradicinina, calicreína, óxido nítrico e citocinas, em modelo de inflamação aguda. Embora o consumo de dietas enriquecidas com óleo de peixe tem também sido associado à diminuição da inflamação crônica, dietas hiperlipídicas parecem aumentar o risco de desenvolvimento da colite ulcerativa e de câncer de colon. Neste trabalho, verificamos se dietas hiperlipídicas ou normolipídicas, enriquecidas com óleo de peixe, óleo de soja ou com a mistura desses podem alterar o processo inflamatório, a liberação de mediadores inflamatórios e o dano oxidativo do DNA na colite experimental, induzida por sulfato de sódio dextran (DSS). Para isto, ratos machos Wistar, recém-desmamados foram divididos em 6 grupos, alimentados durante 47 dias com as dietas experimentais; 3 grupos foram alimentados com dietas hiperlipídicas (20%), ricas em óleo de soja (HS), óleo de peixe (HP) ou mistura de óleo de soja e peixe (HSP) e 3 grupos foram alimentados com dietas normolipídicas (5%) enriquecidas com óleo de soja (S), óleo de peixe (P) ou mistura de óleo de soja e peixe (SP). A dieta S foi o controle tanto dos grupos hiperlipídicos como dos grupos normolipídicos. A colite foi induzida, em todos os animais, no dia 36, com 3% de DSS na água de beber por 7 dias (dia 36 ao 42). No 43º dia o DSS foi descontinuado e no 48º dia os animais foram sacrificados, após jejum alimentar de 24 horas. Durante a indução da colite foi avaliado diariamente o índice de atividade da doença (IAD). Foram coletadas amostras sanguíneas para dosagem de corticosterona, o fígado para análise da incorporação dos ácidos graxos e o cólon distal que foi dividido em fragmentos para análise histológica, dano oxidativo de DNA, dosagem da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) e das concentrações teciduais das citocinas IL-4, IFNg e IL-10. Nos grupos alimentados com dietas hiperlipídicas não foram encontradas diferenças nas concentrações de IL-4 e INF-g, MPO, corticosterona, índice de inflamação, comprimento do cólon e IAD. No entanto, a dieta HP aumentou as concentrações de IL-10 em relação à dieta HS e somente a dieta HSP aumentou a razão IL-10/IL-4 (citocina antiinflamatória / proinflamatória) associada à diminuição do dano de DNA. Esses dados demonstram que dietas hiperlipídicas, ricas em óleo de soja ou peixe, não exacerbam a colite experimental em relação ao controle normolipídico (S), e que a mistura desses óleos tem efeito benéfico no equilíbrio das citocinas e na manutenção da integridade do DNA. Nos grupos alimentados com dietas normolipídicas não foram observadas diferenças nos níveis de corticosterona, IFN-g e IL-4. Somente a dieta SP diminuiu o IAD, a MPO e o índice de inflamação, além de aumentar a IL-10 e proteger contra o dano de DNA em relação ao controle (S). A dieta P promoveu um efeito intermediário, não sendo diferente do controle e da dieta SP, em relação à gravidade da doença, porém aumentou os níveis de IL-10 e diminuiu o dano de DNA em relação à dieta controle (S). Adicionalmente, foi observado uma alta correlação entre o aumento de IL-10 e a diminuição do dano de DNA. Esses dados demonstram que a dieta normolipídica SP reduz a injúria colônica e o dano de DNA e sugerem que essa dieta (SP) pode contribuir como terapia complementar na colite ulcerativa para diminuir o uso de drogas antiinflamatórias e prevenir o câncer de colon. / Background: Ulcerative colitis (UC) is characterized by recurrent episodes of colonic inflammation with an imbalance in the synthesis and release of cytokines. Chronic colonic inflammation has been associated with DNA damage and colorectal cancer. Dietary polyunsaturated fatty acids (PUFA), can modulate immune function, inflammation and carcinogenesis. Therefore, we investigated whether PUFA could influence colonic injury, plasma corticosterone and tissue myeloperoxidase activity (MPO), DNA damage and cytokines in colitic rats. Methods: Male weaning Wistar rats were fed for 47 days with an AIN-93 diet with control (C), fish (F) or a mixture of fish and soybean oil (SF). UC was induced from day 36 until day 42 by 3% DSS in drinking water. On day 48, the rats were anesthetized and, blood samples were collected for corticosterone determination. The distal colon was excised for histological analysis and to quantify the cytokine (IL- 4, IL-10 and INF-g), MPO and DNA damage. The disease activity index (DAI) was recorded daily during colitis induction. Results: DAI, MPO, histological analyses showed decreases (p<0.05) only in the SF group compared with the C group. IL-10 was increased and DNA damage was reduced in the groups F and SF, and an inverse correlation between these variables (r=0.77) was found. There were no differences in corticosterone, IFN-g and IL-4 levels. Conclusions: Soybean and fish oil mixture may be effective in improving colonic injury and DNA damage, and it could be an important complementary therapy in UC to reduce the use of anti-inflammatory drugs and prevent colorectal cancer. Running head: PUFA and colonic inflammation / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

As peroxirredoxinas constituem uma família de tiol-proteínas, que reduzem peróxido de hidrogênio, peróxidos orgânicos e peroxinitrito a água, álcool e nitrito, respectivamente, utilizando equivalentes redutores fornecidos pela tiorredoxina, tiorredoxina redutase e NADPH. As peroxirredoxinas são enzimas abundantes (constituem aproximadamente 0,7 % do total de proteínas solúveis presentes em leveduras) e foram identificadas em diversas espécies de animais, plantas e bactérias, porém seu papel fisiológico ainda é discutido. Até recentemente, as peroxirredoxinas eram consideradas pouco eficientes para detoxificar peróxidos, em comparação às catalases e heme-peroxidases. De fato, as constantes de segunda ordem determinadas para as reações de peroxirredoxinas com peróxido de hidrogênio eram da ordem de 104-105 M-1 s-1, valores muito menores que os de hemeproteínas (~107 M-1 s-1). Neste trabalho, um método de cinética competitiva foi desenvolvido para re-determinar essas constantes de velocidade, utilizando a peroxidase de raiz forte como competidora das peroxirredoxinas de S. cerevisiae, Tsa1 e Tsa2. Este método foi validado e as constantes de velocidade determinadas para Tsa1 e Tsa2 foram da ordem de k~ 107 M-1 s-1 para a reação com peróxido de hidrogênio e da ordem de k~10105 M-1 s-1 para a reação com peroxinitrito. Utilizando a mesma metodologia, foi possível ainda determinar o pKa da cisteína peroxidásica da Tsa1 e Tsa2 (Cys47), como sendo 5,4 e 6,3, respectivamente. Paralelamente, o papel fisiológico das peroxirredoxinas foi examinado em linhagens de S. cerevisiae com deleção de Tsa1, Tsa2 ou de ambas isoformas. Os estudos foram realizados sob condições fermentativas e a linhagem tsa1&#916;tsa2&#916; se mostrou mais resistente ao peróxido de hidrogênio (1 mM) e o consumiu mais rapidamente que a WT. Além disso, a linhagem tsa1&#916;tsa2&#916; produziu quantidades mais altas do radical 1-hidroxietila, produto da oxidação do etanol, que é o principal metabólito da levedura em anaerobiose. O mecanismo de formação do radical 1-hidroxietila foi examinado e a quantificação da concentração de ferro quelatável, ferro total e cobre mostrou que a reação de Fenton não era sua principal fonte. Outro mecanismo investigado foi a formação do radical através da atividade peroxidásica da Sod1, cuja expressão e atividade se mostraram aumentadas cerca de 5 e 2 vezes, respectivamente, na linhagem tsa1&#916;tsa2&#916;. Na linhagem mutante ainda foi observado que o tratamento com peróxido de hidrogênio aumentou a concentração de radicais derivados e adutos do DNA, detectados por imuno-spin trapping e incorporação de 14C derivado da glicose. Em conjunto, os resultados deste trabalho reforçam a importância das peroxirredoxinas na defesa antioxidante e mostram que as respostas compensatórias empregadas pela levedura para contornar as deleções de Tsa1 e Tsa2 podem ser deletérias longo prazo. / Peroxiredoxins constitute a family of cysteine-based peroxidases that are able to reduce hydrogen peroxide, organic peroxides and peroxinitrite to water, alcohol and nitrite, respectively, through the use of reducing equivalents provided by thioredoxin, thioredoxin reductase and NADPH. Peroxiredoxins are abundant enzymes (correspond to approximately 0.7% of total soluble protein in yeasts) and have been identified in several species ranging from animals, plants and bacteria, but their physiological role remains under scrutiny. Peoxiredoxins were regarded as less eficient enzymes in comparison with catalases and heme-peroxidases for detoxification of peroxides. Second-order rate constants determined for the reaction of peroxiredoxins with hydrogen peroxide were in the range of 104-105 M-1 s-1, which is quite low, as compared with those of heme-proteins (~107 M-1 s-1). In the present work, a competitive kinetic approach with horseradish peroxidase was developed in order to determine the second order rate constant of the reaction of peroxiredoxins with peroxynitrite and hydrogen peroxide. This method was validated and permitted for the determination of the second order rate constant value of the reaction of Tsa1 and Tsa2 with peroxynitrite (k~105 M-1 s-1) and hydrogen peroxide (k~ 107 M-1 s-1) at pH 7.4, 25 &#176;C. It also permitted the determination of the pKa of the peroxidatic cysteine of Tsa1 and Tsa2 (Cys47) as 5.4 and 6.3, respectively. In parallel, the physiological role of peroxiredoxins was examined in S. cerevisiae strains with deletion of Tsa1, Tsa2 or of both isoforms. Under fermentative conditions, tsa1&#916;tsa2&#916; cells were more resistant to 1 mM hydrogen peroxide than WT cells, and consumed it faster. In addition, tsa1tsa2 cells produced higher yields of the 1- hydroxyethyl radical from the oxidation of the glucose metabolite ethanol, as shown by spintrapping experiments. A major role for Fenton chemistry in radical formation was excluded by comparing WT and tsa1&#916;tsa2&#916; cells with respect to their levels of chelatable iron ions, total iron and copper ions, and of 1-hydroxyethyl radical produced in the presence of metal ion chelators. The main route for 1-hydroxyethyl radical formation was ascribed to the peroxidase activity of Sod1, whose expression and activity increased about five- and twofold, respectively, in tsa1&#916;tsa2&#916; compared to WT cells. Relevantly, tsa1&#916;tsa2&#916; cells challenged with hydrogen peroxide contained higher levels of DNA-derived radicals and adducts as monitored by immuno-spin trapping and incorporation of 14C from glucose into DNA, respectively. Taken together, our results reinforce the importance of peroxiredoxins in the antioxidant defense show that the compensatory responses employed by yeast to counterbalance the deletions of Tsa1 and Tsa2 may be deleterious in the long time range.

As peroxirredoxinas constituem uma família de tiol-proteínas, que reduzem peróxido de hidrogênio, peróxidos orgânicos e peroxinitrito a água, álcool e nitrito, respectivamente, utilizando equivalentes redutores fornecidos pela tiorredoxina, tiorredoxina redutase e NADPH. As peroxirredoxinas são enzimas abundantes (constituem aproximadamente 0,7 % do total de proteínas solúveis presentes em leveduras) e foram identificadas em diversas espécies de animais, plantas e bactérias, porém seu papel fisiológico ainda é discutido. Até recentemente, as peroxirredoxinas eram consideradas pouco eficientes para detoxificar peróxidos, em comparação às catalases e heme-peroxidases. De fato, as constantes de segunda ordem determinadas para as reações de peroxirredoxinas com peróxido de hidrogênio eram da ordem de 104-105 M-1 s-1, valores muito menores que os de hemeproteínas (~107 M-1 s-1). Neste trabalho, um método de cinética competitiva foi desenvolvido para re-determinar essas constantes de velocidade, utilizando a peroxidase de raiz forte como competidora das peroxirredoxinas de S. cerevisiae, Tsa1 e Tsa2. Este método foi validado e as constantes de velocidade determinadas para Tsa1 e Tsa2 foram da ordem de k~ 107 M-1 s-1 para a reação com peróxido de hidrogênio e da ordem de k~10105 M-1 s-1 para a reação com peroxinitrito. Utilizando a mesma metodologia, foi possível ainda determinar o pKa da cisteína peroxidásica da Tsa1 e Tsa2 (Cys47), como sendo 5,4 e 6,3, respectivamente. Paralelamente, o papel fisiológico das peroxirredoxinas foi examinado em linhagens de S. cerevisiae com deleção de Tsa1, Tsa2 ou de ambas isoformas. Os estudos foram realizados sob condições fermentativas e a linhagem tsa1&#916;tsa2&#916; se mostrou mais resistente ao peróxido de hidrogênio (1 mM) e o consumiu mais rapidamente que a WT. Além disso, a linhagem tsa1&#916;tsa2&#916; produziu quantidades mais altas do radical 1-hidroxietila, produto da oxidação do etanol, que é o principal metabólito da levedura em anaerobiose. O mecanismo de formação do radical 1-hidroxietila foi examinado e a quantificação da concentração de ferro quelatável, ferro total e cobre mostrou que a reação de Fenton não era sua principal fonte. Outro mecanismo investigado foi a formação do radical através da atividade peroxidásica da Sod1, cuja expressão e atividade se mostraram aumentadas cerca de 5 e 2 vezes, respectivamente, na linhagem tsa1&#916;tsa2&#916;. Na linhagem mutante ainda foi observado que o tratamento com peróxido de hidrogênio aumentou a concentração de radicais derivados e adutos do DNA, detectados por imuno-spin trapping e incorporação de 14C derivado da glicose. Em conjunto, os resultados deste trabalho reforçam a importância das peroxirredoxinas na defesa antioxidante e mostram que as respostas compensatórias empregadas pela levedura para contornar as deleções de Tsa1 e Tsa2 podem ser deletérias longo prazo. / Peroxiredoxins constitute a family of cysteine-based peroxidases that are able to reduce hydrogen peroxide, organic peroxides and peroxinitrite to water, alcohol and nitrite, respectively, through the use of reducing equivalents provided by thioredoxin, thioredoxin reductase and NADPH. Peroxiredoxins are abundant enzymes (correspond to approximately 0.7% of total soluble protein in yeasts) and have been identified in several species ranging from animals, plants and bacteria, but their physiological role remains under scrutiny. Peoxiredoxins were regarded as less eficient enzymes in comparison with catalases and heme-peroxidases for detoxification of peroxides. Second-order rate constants determined for the reaction of peroxiredoxins with hydrogen peroxide were in the range of 104-105 M-1 s-1, which is quite low, as compared with those of heme-proteins (~107 M-1 s-1). In the present work, a competitive kinetic approach with horseradish peroxidase was developed in order to determine the second order rate constant of the reaction of peroxiredoxins with peroxynitrite and hydrogen peroxide. This method was validated and permitted for the determination of the second order rate constant value of the reaction of Tsa1 and Tsa2 with peroxynitrite (k~105 M-1 s-1) and hydrogen peroxide (k~ 107 M-1 s-1) at pH 7.4, 25 &#176;C. It also permitted the determination of the pKa of the peroxidatic cysteine of Tsa1 and Tsa2 (Cys47) as 5.4 and 6.3, respectively. In parallel, the physiological role of peroxiredoxins was examined in S. cerevisiae strains with deletion of Tsa1, Tsa2 or of both isoforms. Under fermentative conditions, tsa1&#916;tsa2&#916; cells were more resistant to 1 mM hydrogen peroxide than WT cells, and consumed it faster. In addition, tsa1tsa2 cells produced higher yields of the 1- hydroxyethyl radical from the oxidation of the glucose metabolite ethanol, as shown by spintrapping experiments. A major role for Fenton chemistry in radical formation was excluded by comparing WT and tsa1&#916;tsa2&#916; cells with respect to their levels of chelatable iron ions, total iron and copper ions, and of 1-hydroxyethyl radical produced in the presence of metal ion chelators. The main route for 1-hydroxyethyl radical formation was ascribed to the peroxidase activity of Sod1, whose expression and activity increased about five- and twofold, respectively, in tsa1&#916;tsa2&#916; compared to WT cells. Relevantly, tsa1&#916;tsa2&#916; cells challenged with hydrogen peroxide contained higher levels of DNA-derived radicals and adducts as monitored by immuno-spin trapping and incorporation of 14C from glucose into DNA, respectively. Taken together, our results reinforce the importance of peroxiredoxins in the antioxidant defense show that the compensatory responses employed by yeast to counterbalance the deletions of Tsa1 and Tsa2 may be deleterious in the long time range.